تصوير مستقبلات الاستروجين في الشرايين α بيال فأر باستخدام مجهر رقمي مناعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف تقنية بسيطة لتحسين صبغ وتصور مستقبل الإستروجين ألفا باستخدام مقاطع عرضية لشرايين القشرة التي تم الحصول عليها من أدمغة الجرذان الإناث. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة شرايين القشرة المصبوغة بصبغة إيفانز الزرقاء من سطح الدماغ، ثم تقطيعها إلى حلقات بسمك ثمانية ميكرون باستخدام جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat) بعد عملية التقطيع. تُثبت المقاطع العرضية على شرائح زجاجية وتُحضن مع الجسم المضاد الأولي الموجه ضد مستقبل الإستروجين ألفا.

بعد ذلك، يتم تحضين المقاطع مع الجسم المضاد الثانوي والصبغة المقابلة باستخدام وسائط التثبيت التي تحتوي على dpi. وأخيراً، يتم تصوير قطع الأوعية الدموية للقشرة المحددة بفلورسنت وتحويلها إلى صور ثنائية الأبعاد (2D) باستخدام برنامج التركيز ممتد العمق. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر مستقبلات الإستروجين ألفا في الشريينات القشرية من خلال استخدام مجهر نيكون للفلورسنت المناعي مع برنامج ممتد العمق.

اسمي الدكتورة مارجريت ليتلتون كيرني. سيقوم اليوم الدكتور نيل فاراني، وهو زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري، بشرح إجراء بسيط من أجل تحسين عملية التصوير والتلوين لمستقبل الإستروجين ألفا (estrogen receptor alpha) في القشرة.

شرايين من دماغ جرذ تم ترويته بصبغة إيفانز الزرقاء وحفظه في درجة حرارة 70- درجة مئوية. باستخدام مجهر تشريحي، حدد الشرايين القشرية على سطح الدماغ وقم بإزالتها باستخدام ملاقط دقيقة الطرف، مع إزالة أي أنسجة دماغية ملتصقة بعناية.

ضع الشرايين في أنبوب اختبار صغير على الثلج. قم بتثبيت الشرايين في فورمالدهيد بارد بتركيز 2% في 0.1 mole من PBS لمدة 30 دقيقة. ولتحضير الشرايين للتقطيع، صب وسط التضمين على قرص تجميد مضبوط عند درجة حرارة minus 20 degrees Celsius.

ضع جزءاً من الشريان بشكل مسطح على مبرد التجميد (chug) وانتظر حتى يتجمد. وبمجرد أن يتجمد بإحكام، ضع الشريان بوضع عمودي في وسيط التضمين على قرص التجميد الخاص بجهاز الميكروتوم المبرد (cryostat). تأكد من أن طرف الشريان يتجه إلى الأمام.

أمسِك الشريان بملقط حتى يتجمد تماماً. ضع قرص التجميد الذي يحتوي على الشريان في رأس الميكروتوم المجمد (cryostat)، ثم اقطع حلقات شريانية رقيقة بسمك ثمانية ميكرون مباشرة على شريحة زجاجية. ثبّت المقاطع الشريانية على جيلاتين بوتاسيوم الكروم.

قم بتسوية الشرائح باستخدام فرشاتي طلاء لفرد الحلقات الشريانية. تُحفظ الشرائح المُجهزة في صندوق شرائح داخل الثلاجة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. أخرج الشرائح من الثلاجة واتركها حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة على سطح المختبر.

اغسل الشرائح باستخدام 1 إلى 1.5 مللي لتر من PBS بتركيز 0.1 مولار. بعد 10 دقائق، قم بتصريف PBS وكرر العملية مرتين إضافيتين. بعد غسلة PBS النهائية، حضن الشرائح في 1 مللي لتر من كلوريد الأمونيوم بتركيز 50 ميلي مولار لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ومن أجل تقليل الفلورة الداخلية، اغسل الشرائح في 0.1 مولار PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة كما تم وصفه سابقاً. بعد ذلك، قم بحجب الشرائح في محلول PBS يحتوي على 0.1% Triton X 100 بالإضافة إلى 1% مصل ماعز طبيعي لمدة 30 دقيقة لتقليل الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة الأولية.

بعد عملية الحجب، تُحضن الشرائح مع الجسم المضاد الأولي لـ ER alpha المخفف بتركيز 1:500 في محلول الحجب طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. تُخرج الشرائح من الثلاجة وتُترك لتصل إلى درجة حرارة الغرفة. يُغسل أي جسم مضاد أولي غير مرتبط باستخدام 1 إلى 1.5 mL من 0.1% PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق.

في كل مرة، يتم تحضين الشرائح مع Oregon Green, 4 88 secondary anti rabbit في محلول الحجب لمدة ساعتين في الظلام في درجة حرارة الغرفة، وبعد التحضين، تُغسل الشرائح في 0.1 molar PB S ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة، ثم تُنقل إلى غطاء محرك سحب التهوية. ضع قطرة من وسيط التثبيت الذي يحتوي على dappy على العينات، ثم ضع غطاءً زجاجياً فوق العينة. ضع طلاء أظافر شفافاً لإحكام غلق حواف الغطاء الزجاجي واتركه حتى يجف تماماً.

ضع الشرائح المُجهزة التي تحتوي على مقاطع أوعية القشرة المصبوغة تحت المجهر، ثم قم بالضبط لرؤية المناطق ذات الاهتمام المميَّزة فلورياً. تُعد رؤية ER alpha المصبوغة الخطوة الأكثر صعوبة في هذا الإجراء. ابحث عن مستوى قطع الوعاء الذي تظهر فيه المستقبلات بأكبر قدر من الوضوح.

ابدأ بتكبير 100 مرة ثم ارفع التكبير إلى 600 مرة. استخدم الكاميرا لالتقاط صور في قناتي DPI و ZI لنوى الخلايا و DR alpha على التوالي، ثم استخدم برنامجاً لتحويل المناظر المتعددة لقطع الأوعية إلى صور ثنائية الأبعاد. هنا، تظهر نتائج الصبغ المناعي الفلوري لـ ER alpha باللون الأخضر مع صبغ مضاد باستخدام DPI.

في اللون الأزرق في حلقة شريان مقشرة معزولة من دماغ جرذ أنثى، تشير الصور المدمجة إلى وجود مستقبل الإستروجين ألفا داخل النواة. ومن خلال استخدام مجموعة من صور Zack، يمكن الحصول على صورة مركزة للفلورة المناعية لمستقبل ER ألفا، ويجب إجراء ضوابط سلبية للفلورة الذاتية لكل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية. لاحظ الفلورة الذاتية المتميزة على طول الجانب البطاني لشريان لم يتم تحضينه مع الجسم المضاد الثانوي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب دراية بكيفية عزل وتقشير الشرايين من سطح الدماغ وتحضير حلقات مقطعية بعرض 8 micron. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون ملمّاً بكيفية استخدام مستقبلات الإستروجين ألفا الموّسمة فلورياً، وكيفية تصور هذه المستقبلات باستخدام مجهر مناعي فلوري رقمي وبرنامج Nikon extended.