تصور البروتينات والمجمعات ضخم الجزيئات التي كتبها EM اللطخة السلبية : من إعداد الشبكة إلى الحصول على الصور

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور عينات البروتين النقية عن طريق المجهر الإلكتروني للبقع السلبية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد شبكات المجهر الإلكتروني التي ستدعم العينة أولا. الخطوة الثانية من الإجراء هي تحضير محلول البقع السلبية.

بعد ذلك ، يتم تطبيق العينة على شبكة المجهر الإلكتروني وملطخة بالسالب. أخيرا ، يتم تحميل شبكة EM في مجهر إلكتروني ، ويتم تسجيل الصور في ظل ظروف بصرية مناسبة. تتميز صور DEM التقليدية بتباين عال وتفصيل حاد ، وتظهر جزيئا كبيرا مفردا مبعثرا على خلفية عديمة الميزات.

المجهر الإلكتروني للبقع السلبية هو طريقة بسيطة لتصور البروتين المفضل لديك. يمكن استخدامه كمقايسة روتينية لفحص البروتين المنقى ، إما للتحليل الهيكلي أو غيرها من المقايسات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية. نوضح هنا كيفية تحضير عينة ملطخة سالبا للفحص المجهري الإلكتروني.

العرض المرئي لهذه الطريقة مفيدا حيث يصعب تعلم بعض الخطوات من أوصاف النص والأشكال. ابدأ باستخدام ماصة زجاجية لوضع قطرة واحدة من الكولوديون في كوب كبير من الماء على سطح الماء. مع انتشار الكولوديون ، قد يلتقط الغبار من سطح الماء.

قم بإزالة واستبدال فيلم مترب من بلاستيك الكولوديون بقطرة أخرى. ضع بعد ذلك بين 50 و 100 شبكة EM واحدة تلو الأخرى على الجانب اللامع للفيلم البلاستيكي العائم لأسفل. حدد 400 شبكة شبكية للبقع السلبية الروتينية وحدد 200 شبكة شبكية.

لجمع صور زوج الإمالة. حدد قطعة من الورق غير المجعد بطيء الامتصاص أكبر قليلا من مساحة الشبكات. ضع الورقة أعلى الشبكات وانتظر حتى يصبح الورق رطبا تماما.

يجب ألا يمتص الورق الماء بسرعة كبيرة. نستخدم الورق من مفكرة رخيصة. الشبكات محصورة الآن بين الفيلم البلاستيكي والورق.

استخدم زوجا من الملقط لوضع الورق في طبق بتري حتى يجف ببطء في الهواء. تجنب طرق التجفيف الأسرع لأنها قد تؤدي إلى التجاعيد. آلة طلاء الكربون المستخدمة في مختبرنا هي Creston 2 0 8 C عالية فراغ توربو الكربون coer.

مجهزة بشاشة سمك فيلم Creston. تستخدم الشاشة ميزان كوارتز حساس لرواسب الكربون. ومع ذلك ، فإن البروتوكول الموضح هنا لا يتطلب هذا الجهاز ابدأ بشحذ قضبان الكربون وتحميلها في آلة طلاء الكربون.

الطبقة التالية ، شريحة زجاجية مع شحم مفرغ تترك نصف المنطقة المتجمدة غير مطلية بعد طلاء الكربون ، يتم استخدام المناطق المدهونة من الشريحة لتقدير سمك طبقة الكربون. ضع الورق مع الشبكات على المسرح أسفل جرة الجرس لآلة طلاء الكربون. ضع الزجاج المدهون.

مرر بجوار الشبكات. قم بضخ غرفة التفريغ حتى 10 جولات صغيرة على الأقل ، وإلا فإن الشرارة ستولد العديد من الجسيمات الكبيرة في الشبكة. الآن قم بزيادة التيار ببطء شديد.

سيصبح الطرف الحاد لقضيب الكربون ساطعا للغاية. لا تلاحظه بالعين المجردة عندما يبدأ الطلاء ، ستتغير الشريحة الزجاجية إلى اللون الرمادي الداكن مع تراكم طبقة الكربون ، وتقطع التيار بسماكة الكربون المطلوبة وتضع في الاعتبار شفافية جرة الجرس. عند إصدار هذا الحكم ، بمجرد معايرة ظلام الشريحة إلى سمك الكربون ، تكون هذه الطريقة دقيقة مثل جهاز مراقبة سمك الفيلم الأكثر تكلفة.

عند الانتهاء من العملية ، قم بتنفيس غرفة التفريغ وإزالة الشبكات المطلية لاستخدامها لاحقا. لن تؤثر الطبقة البلاستيكية الرقيقة على جودة الصورة الملطخة سلبا ، ولكن يمكن إزالتها عن طريق نقع الشبكات في الكلوروفورم لعدة ساعات قبل المتابعة. اصنع محلول فورمات L للبول الطازج أو استخدم المحلول الذي تم تخزينه في الظلام لمدة تقل عن أسبوعين.

يحتوي المحلول الطازج الجيد على لون أصفر ، ودرجة حموضة تبلغ حوالي أربعة ويعمل نظيفا جدا بدون رواسب. ابدأ باستخدام نظام متاح تجاريا للتوهج. تفريغ الشبكات المطلية بالكربون.

في المرتبة التالية ، قطرتان من الماء المقطر سعة 20 ميكرولتر و 2 25 قطرة ميكرولتر من محلول فورمات المبولة الطازجة على قطعة من البرفيل. باستخدام ملقط مضاد للشعيرات الدموية بقوة عكسية ، أمسك شبكة تفريغ متوهجة ، الجانب المطلي بالكربون لأعلى. بشكل حاسم ، هذه الملقط لا تمتص السائل من الشبكات.

الآن ضع ميكرولترين من عينة البروتين على الشبكة وانتظر حتى يتم امتصاص البروتينات في الشبكة. يستغرق هذا عادة 30 ثانية ، لكن العينات المخففة جدا تتطلب مزيدا من الوقت ، مما قد يؤثر على تركيزات المخزن المؤقت. عند الانتهاء ، امسح عينة البروتين باستخدام ورق الترشيح.

ثم اغسل الشبكة مرتين عن طريق لمس سطحها لفترة وجيزة بقطرة ماء وتجفيفها في غضون ثوان قليلة. بعد أن لمس الماء الشبكة لفترة وجيزة إلى قطرة من البقعة وتجف بسرعة. باستخدام نفس الأسلوب ، اسمح للشبكة بالتلامس مع قطرة ثانية من البقعة لمدة 20 ثانية.

أخيرا ، قم بتجفيف الشبكة بالهواء على غطاء الدخان ، أو يفضل أن يكون في فراغ قبل جلسة EM ، وتحقق من محاذاة المجهر EM الذي يقوم بتحميل ملف محاذاة مثالي إذا كان متاحا ، ويجب استعادته إلى حالة شبه مثالية. الآن قم بتحميل شبكة EM على حامل عينة قياسي واحد للإمالة. بعد ذلك ، أدخل الحامل في المسرح.

ثم انتظر حتى تكتمل دورة الضخ وأدخل الحامل في العمود. ابدأ الآن في البحث عن منطقة عينة بها وصمة عار جيدة. قم بالتركيز يدويا باستخدام طريقة الحد الأدنى من التباين أو باستخدام كاميرا CC و D وحساب الأربعة الحية.

طيف القوة الخاص بك. ثم اضبط التركيز العميق حسب الحاجة ، عادة على سالب 1.5 ميكرون. يمكن أن يختلف تركيز البقع عبر الشبكة ، لذا ابحث عن البروتينات ذات التباين الأبيض.

تجنب المناطق ذات البقع غير المستوية أو البقع الإيجابية حيث يصبح تباين البروتين أسود. استخدام النهج الموضح لعمل الشبكات وتصور العينات الملطخة سلبا. تم تصوير العديد من البروتينات المألوفة لأغراض العرض التوضيحي.

لاحظ تفاصيلها وتباينها الحاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء عينات من الجزيئات الكبيرة الملطخة سالبا للمراقبة في المجهر الإلكتروني. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في حوالي أربع ساعات.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل إعادة البناء ثلاثية الأبعاد من أجل فهم الهياكل الجزيئية بشكل أفضل.