تصور البروتينات والمجمعات ضخم الجزيئات التي كتبها EM اللطخة السلبية : من إعداد الشبكة إلى الحصول على الصور

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور عينات البروتين المنقاة باستخدام المجهر الإلكتروني بصبغة سلبية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير شبكات المجهر الإلكتروني التي ستدعم العينة. أما الخطوة الثانية من الإجراء فهي تحضير محلول الصبغة السلبية.

بعد ذلك، يتم وضع العينة على شبكة المجهر الإلكتروني وتصبيغها بالصبغة السالبة. وأخيرًا، تُوضع شبكة المجهر الإلكتروني في المجهر الإلكتروني، ويتم تسجيل الصور تحت ظروف بصرية مناسبة. وتتميز صور DEM التقليدية ذات المجال المضيء بتباين عالٍ وتفاصيل دقيقة، حيث تظهر جزيئات كبيرة منفردة مبعثرة فوق خلفية خالية من المعالم.

يُعد المجهر الإلكتروني بالصبغة السالبة طريقة بسيطة لتصوير البروتين المفضل لديك. ويمكن استخدامه كاختبار روتيني لفحص البروتين المنقى، سواء للتحليل البنيوي أو للاختبارات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية الأخرى. ونوضح هنا كيفية تحضير عينة مصبوغة صبغاً سالباً للفحص بالمجهر الإلكتروني.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة مفيداً نظراً لصعوبة تعلم بعض الخطوات من خلال الأوصاف النصية والأشكال التوضيحية. ابدأ باستخدام ماصة زجاجية لوضع قطرة واحدة من الكولوديون على سطح الماء في دورق زجاجي كبير يحتوي على الماء. وبينما ينتشر الكولوديون، قد يلتقط الغبار الموجود على سطح الماء.

قم بإزالة غشاء بلاستيكي من الكولوديون متراكم عليه الغبار واستبدله بقطرة أخرى. بعد ذلك، ضع ما بين 50 و100 شبكة EM واحدة تلو الأخرى على الغشاء البلاستيكي العائم بحيث يكون الجانب اللامع للأسفل. اختر شبكات ذات مسام 400 mesh لعمليات الصبغ السلبي الروتينية واختر شبكات ذات مسام 200 mesh.

لجمع صور الأزواج المائلة. اختر قطعة من الورق غير المجعد بطيء الامتصاص تكون أكبر قليلاً من مساحة الشبكات. ضع الورق فوق الشبكات وانتظر حتى يبتل الورق تماماً.

يجب ألا تمتص الورقة الماء بسرعة كبيرة. نستخدم ورقة من مفكرة رخيصة الثمن. أصبحت الشبكات الآن محصورة بين الغشاء البلاستيكي والورقة.

استخدم ملقطاً لوضع الورقة في طبق بتري لتجف ببطء في الهواء. تجنب طرق التجفيف السريعة لأنها قد تؤدي إلى ظهور تجاعيد. جهاز الطلاء بالكربون المستخدم في مختبرنا هو Creston 2 0 8 C high vacuum turbo carbon coer.

مجهز بجهاز Creston لمراقبة سمك الطبقة. يستخدم جهاز المراقبة ميزان كوارتز حساساً لرواسب الكربون. ومع ذلك، فإن البروتوكول الموضح هنا لا يتطلب استخدام هذا الجهاز. ابدأ بشحذ وتحميل قضبان الكربون في آلة طلاء الكربون.

في الخطوة التالية، يتم طلاء شريحة زجاجية باستخدام شحم الفراغ مع ترك نصف المنطقة المتجمدة بدون طلاء. وبعد عملية الطلاء بالكربون، تُستخدم المناطق المدهونة بالشحم على الشريحة لتقدير سمك طبقة الكربون. ضع الورقة التي تحتوي على الشبكات على المنصة تحت الجرس الزجاجي لآلة الطلاء بالكربون، ثم ضع الزجاج المدهون في موضعه.

قم بتمرير الشريحة بجوار الشبكات. قم بتفريغ غرفة المفرغة حتى تصل إلى 10 micro tours على الأقل، وإلا فإن حدوث الشرارات سيؤدي إلى توليد العديد من الجسيمات الكبيرة في الشبكة. الآن، قم بزيادة التيار ببطء شديد.

ستصبح النهاية المدببة لقضيب الكربون ساطعة للغاية. لا تراقبها بالعين المجردة عند بدء عملية الطلاء، حيث ستتغير لون الشريحة الزجاجية إلى الرمادي الداكن مع تراكم طبقة الكربون، اقطع التيار عند سماكة الكربون المطلوبة مع مراعاة شفافية الوعاء الزجاجي. وعند اتخاذ هذا التقدير، وبمجرد معايرة درجة قتامة الشريحة وفقاً لسماكة الكربون، تصبح هذه الطريقة دقيقة تماماً مثل أجهزة مراقبة سماكة الفيلم الأكثر تكلفة.

عند انتهاء العملية، قم بتفريغ غرفة التخلخل وإخراج الشبكات المطلية لاستخدامها لاحقاً. لن تؤثر الطبقة البلاستيكية الرقيقة على جودة الصورة المصبوغة سلبياً، ولكن يمكن إزالتها عن طريق نقع الشبكات في الكلوروفورم لعدة ساعات قبل المتابعة. قم بتحضير محلول فورمات اليورانيوم الطازج أو استخدم محلولاً تم تخزينه في الظلام لمدة تقل عن أسبوعين.

يتميز المحلول الطازج الجيد بلون أصفر، ودرجة pH تبلغ حوالي أربعة، ويكون نقياً جداً دون وجود أي رواسب. ابدأ باستخدام نظام متاح تجارياً للتوهج (glow discharge). قم بتفريغ الشحنات من الشبكات المطلية بالكربون.

بعد ذلك، ضع قطرتين بحجم 20 µL من الماء المقطر وقطرتين بحجم 25 µL من محلول فورمات البول الطازج على قطعة من ورق البارافين. باستخدام ملقط شعيري مضاد للقوة العكسية، أمسك شبكة مفرغة من الشحنات، بحيث يكون الجانب المطلي بالكربون للأعلى. ومن الأهمية بمكان أن هذه الملاقط لا تسحب السوائل من الشبكات.

قم الآن بوضع 2 µL من عينة البروتين على الشبكة وانتظر حتى يتم امتصاص البروتينات داخلها. تستغرق هذه العملية عادةً 30 ثانية، ولكن العينات المخففة جداً ستتطلب وقتاً أطول، مما قد يؤثر على تركيزات المنظم. عند الانتهاء، قم بتجفيف عينة البروتين باستخدام ورق ترشيح.

بعد ذلك، اغسل الشبكة مرتين عن طريق ملامسة سطحها لفترة وجيزة بقطرة من الماء ثم تجفيفها بالتربيت خلال ثوانٍ قليلة. وبعد ملامسة الماء للشبكة لفترة وجيزة، قم بملامستها بقطرة من الصبغة ثم جففها بسرعة بالتربيت. وباستخدام التقنية ذاتها، اترك الشبكة في حالة تلامس مع قطرة ثانية من الصبغة لمدة 20 ثانية.

وأخيراً، جفف الشبكة بالهواء في خزانة استخلاص الأدخنة، أو يفضل في جهاز تفريغ قبل جلسة المجهر الإلكتروني (EM)، وتحقق من محاذاة المجهر الإلكتروني عبر تحميل ملف محاذاة مُتقن إذا كان متاحاً، وهو ما ينبغي أن يعيد المجهر إلى حالة قريبة من المثالية. الآن، ضع شبكة المجهر الإلكتروني في حامل عينات قياسي أحادي الإمالة. بعد ذلك، أدخل الحامل في المنصة.

بعد ذلك، انتظر حتى تكتمل دورة الضخ وأدخل الحامل في العمود. ابدأ الآن بالبحث عن منطقة عينة ذات صبغة جيدة. قم بضبط التركيز يدوياً باستخدام طريقة التباين الأدنى أو باستخدام كاميرا CC, D وحساب الـ live four.

طيف القدرة الخاص بك. ثم اضبط التركيز العميق حسب الحاجة، وعادة ما يكون على -1.5 ميكرون. قد يختلف تركيز الصبغة عبر الشبكة، لذا ابحث عن البروتينات ذات التباين الأبيض.

تجنب المناطق ذات الصبغة غير المتساوية أو الصبغة الإيجابية حيث يصبح تباين البروتين أسود اللون. باستخدام النهج الموضح لتحضير الشبكات وتصوير العينات المصبوغة سلبًا. تم تصوير عدة بروتينات مألوفة لأغراض التوضيح.

لاحظ تفاصيلها وتباينها الحاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تحضير عينات من الجزيئات الكبيرة المصبوغة سلبياً لفحصها باستخدام المجهر الإلكتروني. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أربع ساعات تقريباً.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل إعادة البناء ثلاثي الأبعاد (3D reconstruction) من أجل فهم التراكيب الجزيئية بشكل أفضل.