كفاءة اشتقاق أسلاف الإنسان متعلق بالخلايا العصبية والخلايا العصبية من افرة القوة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

الهدف العام من التجربة التالية هو اشتقاق ذرية عصبية مباشرة وحصرية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية متعددة القدرات باستخدام تحريض جزيء صغير. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة حمض الريتينو إلى الخلايا غير المتمايزة التي يتم الاحتفاظ بها في ظل ظروف محددة. بعد ذلك ، تستمر عملية التمايز عن طريق فصل الخلايا في ثقافة معلقة حيث تشكل مجموعات خلوية عائمة تسمى الخلايا العصبية.

إذا سمح للأرومات العصبية بالالتصاق بلوحة زراعة الأنسجة في وسط التمايز العصبي ، فإنها تطور خصائص الخلايا العصبية الناضجة. في النهاية ، يمكن استخدام التألق المناعي وإزالة الالتفاف أو الفحص المجهري متحد البؤر لإظهار تأثير العلاج بحمض الريتينو في التشكل والتعبير عن العلامات للخلايا الجذعية الجنينية البشرية المعالجة. في تقنيات أخرى ، يتبع جزء صغير فقط من الخلايا نمطا ظاهريا عصبيا ، في حين أن طريقتنا تسمح بالتحريض الفعال الذي يتم التحكم فيه جيدا للخلايا الجذعية الجنينية البشرية متعددة القدرات حصريا نحو سلالة عصبية عن طريق توفير بسيط للجزيئات الصغيرة.

هناك بعض الخطوات التي يجب توخي الحذر فيها عند إصلاح حلول المخزون. احرص على إبطاء ذوبان الجليد واللامينين البشري من 80 درجة مئوية تحت الصفر إلى أربع درجات مئوية طوال الليل ، وقم بتخزين الوسائط طوال الليل عند أربع درجات مئوية وقم دائما بتسخين الوسائط إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. أيضا ، عند تحضير وسائط ESL البشرية ، تتم إضافة بعض المكملات قبل استخدامها مباشرة.

وتشمل هذه BFGF وحمض الأسكوربيك والأنسولين البشري النشط في A والنقل. بعد ذلك ، قم بعمل هلام ماترا أو حلول عمل اللامينين البشري مباشرة قبل طلاء اللوحة. احتضان الألواح عند 37 درجة SIUs في 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد تحضير ألواح زراعة الأنسجة المطلية مسبقا بالجيلاتين.

يمكن استبدال الجيلاتين بمحلول عمل ماتريجل أو لامينين. قم بتغطية هذه الأطباق عن طريق احتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ابدأ بالسماح لمستعمرات الخلايا الجنينية الجنينية البشرية بالنمو لمدة خمسة إلى سبعة أيام ثم استعد للانقسام.

بعضها حدد مستعمرات تحتوي على أكثر من 75٪تحت الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المتمايزة ، عادة ما تكون معتمة قليلا مع مستعمرات حواف محددة تحتوي على خلايا مكدسة. عادة ما يبدو أن المؤشرات على بداية التمايز هي أن المستعمرات البيضاء التي تحتوي على خلايا متمايزة في الغالب عادة ما تبدو واضحة. لا تحدد مستعمرات بيضاء أو واضحة.

امسك الألواح في ضوء واستخدم علامة لتحديد المستعمرات غير الشفافة قليلا في الجزء السفلي من الألواح على طول الخطوط العريضة. استخدم حافة طرف ماصة P معقمة لفصل طبقة الخلايا الليفية المحيطة عن مستعمرة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. ثم قم بإزالة خلايا الخلايا الليفية المحيطة وقم أيضا بإزالة جميع الأجزاء المتمايزة من المستعمرة.

الآن استنشق الوسائط القديمة التي تحتوي على الخلايا المتمايزة المنفصلة. بعد ذلك في كل بئر ، اغسل الخلايا غير المتمايزة مرة واحدة باستخدام وسائط خلوية E es بشرية تفتقر إلى BFGF ، ثم أضف ثلاثة ملليلتر من وسائط ESL البشرية الطازجة التي تحتوي على B-F-G-F-B-F-G-F تضاف إلى الوسائط الجديدة مباشرة قبل الاستخدام. استخدم الآن طرف ماصة P معقم لتقطيع المستعمرات إلى قطع صغيرة وفصلها عن اللوحة.

اسحب قطع المستعمرة المنفصلة في وسائطها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اسحب واحدة إضافية. شطف وسائط المليلتر لكل بئر.

جاهزة الآن لمزيد من التمايز باستخدام جزيئات صغيرة. ابدأ بتسخين الأطباق المطلية حديثا إلى 37 درجة مئوية. قم بشفط محلول الطلاء من الألواح وأضف أربعة ملليلتر من الوسائط التي تحتوي على قطع مستعمرة في كل بئر ثم انقل الألواح برفق إلى حاضنة دون رجها.

لا تزعج الأطباق حتى يسمح لها بالبذر. بعد البذر لمدة ثلاثة أيام ، اصنع وسائط جديدة تحتوي على حمض الأوميك. ثم قم بإزالة معظم الوسائط القديمة ، مع ترك ما يكفي من الوسائط حتى تظل الخلايا مغمورة.

لا ينبغي أبدا السماح للخلايا بالجفاف لكل منها. حسنا أضف أربعة ملليلتر من وسائط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الطازجة مع BFGF وحمض الريتينو. استبدل الوسائط كل يومين واسمح لحمض الريتينو بزراعة مستعمرات الخلايا الجنينية الجنينية البشرية المعالجة بالنمو.

بعد سبعة أو ثمانية أيام ، ستخضع الخلايا لتغييرات مورفولوجية إلى خلايا كبيرة متمايزة. ثم تابع عمل ثقافة الخلايا المعلقة لجعل ثقافة التعليق تبدأ بفصل مستعمرات ESL عن الخلايا التي تمايزت تلقائيا وهاجرت لتشكيل طبقة الخلايا الليفية. استخدم التقنية المذكورة أعلاه بطرف ماصة معقم ، ثم استنشق الوسائط القديمة التي تحتوي على خلايا الخلايا الليفية العائمة المنفصلة.

اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام وسائط HESC وأعد تعليقها في ثلاثة ملليلتر من وسائط HESC. الآن باستخدام طرف ماصة P معقم. نقطع المستعمرات إلى قطع صغيرة ونفصلها عن اللوحة.

اسحب الوسائط ذات المستعمرات المنفصلة إلى أنبوب مخروطي واحد سعة 50 مل. شطف الآبار مع ملليلتر واحد من الوسائط وإضافة شطف إلى حمام السباحة. ثم قم بتجميع أربعة ملليلتر من الخلايا المجمعة في كل بئر من ستة آبار منخفضة للغاية لوحة التثبيت لمدة أربعة إلى خمسة أيام ، واحتفظ باللوحة في حاضنة.

خلال هذا الوقت ، ستتشكل المجموعات الخلوية العائمة أو الخلايا العصبية لزيادة تقدم الخلايا العصبية إلى نمط ظاهري عصبي أكثر نضجا. اسحب الوسائط التي تحتوي عليها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا بسرعة 1 ، 400 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

قم بالشفط ووزن أكبر قدر ممكن من الوسائط القديمة وأضف كمية متساوية من وسائط NSC الجديدة التي تحتوي على VEGF و NT و THREE و BDNF. امزج الخلايا في معلق عن طريق سحب العينات ، ثم قم بتقطيع أربعة ملليلتر من المعلق لكل بئر إلى ستة. تنقل ألواح زراعة أنسجة الآبار الألواح إلى حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.

سوف يعلق الأرومة العصبية على لوحات الثقافة بين عشية وضحاها لثقافة ثلاثية الأبعاد في Matrigel أو صفائح بشرية إلى تعليق الخلايا العصبية. وسوف تتبلمر المصفوفة ثلاثية الأبعاد عند 37 درجة مئوية. استبدل الوسائط كل يومين.

في غضون أسبوعين ، ستظهر شبكات واسعة من الخلايا العصبية الحاملة للعصبية والخلايا المصطبغة حمض الريتينو كافيا لحث الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المحفوظة في نظام الثقافة المحدد للانتقال من تعدد القدرات حصريا إلى النمط الظاهري للبشرة العصبية. عند تعرض خلايا E ES البشرية غير المتمايزة لحمض الريتينويك ، خضعت جميع الخلايا داخل المستعمرة لتغيرات مورفولوجية إلى خلايا كبيرة متمايزة توقفت عن التعبير عن العلامة المرتبطة بتعدد القدرات OCT الرابعة. بدأت الخلايا أيضا في التعبير عن العديد من العلامات المرتبطة بالأديم الظاهر العصبي مثل HNK one a و P two و TRKC.

استمرت هذه الخلايا الكبيرة المتمايزة في التكاثر وزاد حجم المستعمرات تلقائيا معبرا عن علامة الخلايا العصبية المبكرة بيتا ثلاثة توبولين. بدأت خريطة العلامات العصبية الأكثر نضجا في الظهور في مناطق المستعمرات حيث تراكمت الخلايا. من قبيل الصدفة ، مع ظهور خلايا الأديم العصبي الظاهر ، فإن عامل النسخ العصبي المحدد NER واحد متورط في التمايز العصبي الدوبامين وتنشيط جين هيدروكسيلاز التيروزين المنقول إلى النواة.

بعد الانفصال ، شكلت خلايا ES البشرية المعالجة بحمض الريتينو الخلايا العصبية في ثقافة معلقة عند إزالة FGF الأساسي وبعد السماح للخلايا العصبية بالالتصاق بلوحة زراعة الأنسجة ، بدأت شبكات واسعة من الخلايا العصبية الحاملة للعصبية والخلايا المصطبغة ، النموذجية للجهاز العصبي المركزي ، في الظهور مع زيادة كبيرة في الكفاءة ويمكن زراعتها على مدى ثلاثة أشهر. عبرت هذه الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عن بيتا ثلاثة توبولين مقارنة بالتمايز التلقائي متعدد السلالات للخلايا دون علاجات حمض الريتينو والخريطة المشتركة المعبر عنها بمجرد إتقانها. يمكن استخدام هذه التقنية لتوليد أسلاف عصبية في الخلايا العصبية بشكل موحد من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية متعددة القدرات في حوالي أربعة أسابيع إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

لا تنس أن العمل مع الخلايا البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ضمان خلو خطوط الخلايا من مسببات الأمراض والميكوبلازما قبل تنفيذ هذا الإجراء.