كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

الهدف العام من التجربة التالية هو اشتقاق سلالات قلبية بشكل مباشر وحصري من خلايا جذعية جنينية بشرية متعددة القدرات باستخدام التحفيز بجزيئات صغيرة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة النيكوتيناميد إلى خلايا ES بشرية غير متمايزة يتم الحفاظ عليها تحت ظروف محددة. بعد ذلك، يتم فصل الخلايا القلبية المتمايزة لتشكيل أرومات قلبية (cardio blasts)، وهي عبارة عن تجمعات خلوية عائمة في مزرعة معلقة.

بمجرد تشكلها، يتم نقل الخلايا القلبية الأولية (cardio blasts) إلى أوساط تمايز قلبي حيث تستمر في التطور لتصبح خلايا عضلية قلبية نابضة. وفي النهاية، يتم تقييم النتائج عن طريق التألق المناعي باستخدام تقنية فك الالتفاف (deconvolution) أو المجهر البؤري (confocal microscopy)، وكذلك من خلال التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بالتحفيز الفعال للخلايا الجذعية الجنينية البشرية متعددة القدرات للتجه نحو سلالة قلبية حصراً من خلال التوفير البسيط للجزيئات الصغيرة.

بينما في الطرق الحالية للتمايز متعدد السلالات، تتبع نسبة صغيرة فقط من الخلايا النمط الظاهري القلبي. هناك بعض الخطوات التي يجب توخي الحذر فيها عند تحضير المحاليل المخزنة؛ احرص على إذابة matrigel وhuman laminin ببطء من -80 °C إلى 4 °C طوال الليل، واحفظ الأوساط الغذائية عند 4 °C، وقم دائمًا بتدفئة الأوساط إلى 37 °C قبل الاستخدام.

كذلك، عند تحضير وسط الخلايا الجذعية البشرية E es، تُضاف بعض المكملات مباشرة قبل الاستخدام. وتشمل هذه المكملات BFGF، وحمض الأسكوربيك، والأنسولين البشري النشط في A، والترانسفيرين. بعد ذلك، قم بتحضير المحاليل العاملة من الماتريجيل أو اللامينين البشري مباشرة قبل طلاء الأطباق.

بعد تحضير أطباق زراعة الأنسجة المطلية مسبقاً بالجيلاتين، يتم تحضين الأطباق عند 37 °C في 5% carbon dioxide. يمكن استبدال الجيلاتين بمحلول عمل matra gel أو laminin. يتم طلاء هذه الأطباق بتحضينها طوال الليل عند 4 °C.

ابدأ بالسماح لمستعمرات خلايا ES البشرية بالنمو لمدة تتراوح من خمسة إلى سبعة أيام، ثم استعد لتقسيم بعض منها. اختر المستعمرات التي تحتوي على أكثر من 75% من خلايا ES البشرية غير المتمايزة. عادة ما تكون هذه المستعمرات معتمة قليلاً ذات حواف محددة ومكونة من خلايا متراكمة. أما المستعمرات التي تظهر عليها علامات بداية التمايز فتظهر عادة باللون الأبيض، بينما المستعمرات التي تحتوي في الغالب على خلايا متمايزة تظهر عادة شفافة.

تجنب اختيار المستعمرات البيضاء أو الشفافة. ارفع الأطباق باتجاه الضوء واستخدم قلم تحديد لرسم حدود المستعمرات نصف الشفافة الموجودة في قاع الأطباق. استخدم حافة طرف ماصة P two معقمة لفصل طبقة الخلايا الليفية المحيطة عن مستعمرة خلايا ES البشرية.

ثم قم بإزالة خلايا الأرومة الليفية المحيطة وأيضاً إزالة جميع الأجزاء المتمايزة من المستعمرة. والآن قم بشفط الوسط القديم الذي يحتوي على الخلايا المتمايزة المنفصلة. بعد ذلك، اغسل الخلايا غير المتمايزة في كل بئر مرة واحدة باستخدام وسط خلايا ES البشرية الخالي من BFGF، ثم أضف ثلاثة milliliters من وسط خلايا ES البشرية الطازج الذي يحتوي على B-F-G-F-B-F-G-F، حيث يُضاف B-F-G-F-B-F-G-F إلى الوسط الطازج مباشرة قبل الاستخدام.

استخدم الآن طرف ماصة P2 معقم لتقطيع المستعمرات إلى قطع صغيرة وفصلها عن الطبق. اسحب قطع المستعمرات المنفصلة مع الوسط الخاص بها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. اسحب شطفاً إضافياً من الوسط بمقدار one milliliter لكل بئر.

أصبحت الخلايا الآن جاهزة لمزيد من التمايز باستخدام الجزيئات الصغيرة. ابدأ بتدفئة الأطباق المطلية حديثاً إلى 37 درجة مئوية. اشفط محلول الطلاء من الأطباق وأضف حصة قدرها 4 مل من الوسط الذي يحتوي على قطع المستعمرات في كل بئر، ثم انقل الأطباق برفق إلى الحاضنة دون هزها.

تجنب تحريك الأطباق للسماح للخلايا بالالتصاق. بعد ذلك، قم بإزالة معظم الوسط الغذائي القديم، مع ترك كمية كافية فقط لضمان بقاء الخلايا مغمورة. يجب عدم السماح للخلايا بالجفاف مطلقاً.

امزج وسط ESL البشري الطازج الذي يحتوي على FGF الأساسي والنيكوتيناميد، وأضف ملليليترات من هذا الوسط إلى كل بئر. يمكن تخزين الوسط لمدة تصل إلى أسبوعين عند درجة حرارة 4 °C، حيث يمكن استخدامه لتجديد المزرعة الخلوية كل يومين لنمو المستعمرات. بعد 8 إلى 10 أيام، ستخضع الخلايا لتغيرات شكلية لتصبح خلايا متمايزة كبيرة ومتكاثرة ومتراكمة.

بعد ذلك، انتقل إلى زراعة المعلق؛ لبدء زراعة المعلق، ابدأ بفصل مستعمرات ESL عن الخلايا التي تمايزت وتهاجرت تلقائياً لتشكل طبقة أرومة ليفية. استخدم التقنية المذكورة سابقاً باستخدام رأس ماصة معقمة، ثم اشفط الوسط القديم الذي يحتوي على خلايا الأرومة الليفية المنفصلة والعائمة. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام وسط HESC وأعد تعليقها في ثلاثة مللي لتر من وسط HESC باستخدام رأس ماصة P2 معقمة.

قطّع المستعمرات إلى قطع صغيرة وافصلها عن الطبق. اسحب الوسط الغذائي مع المستعمرات المفصولة إلى أنبوب مخروطي واحد سعة 50 milliliter. اشطف الآبار باستخدام one milliliter من الوسط الغذائي وأضف سائل الشطف إلى المزيج.

بعد ذلك، وزع أربعة ملليلتر من الخلايا المجمعة في كل بئر من أطباق ذات ستة آبار فائقة انخفاض الالتصاق لمدة تتراوح بين أربعة إلى خمسة أيام. احفظ الطبق في حضانة للسماح بتكوين تجمعات خلوية عائمة أو أرومات قلبية، وذلك لدفع الأرومات القلبية للوصول إلى النمط الظاهري للخلايا العضلية القلبية النابضة. اجمعها معاً في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر مع الوسط الغذائي الخاص بها.

بعد ذلك، يتم طرد الخلايا مركزياً بسرعة 1,400 RPM لمدة خمس دقائق. يتم سحب الوسط القديم وقياس كتلته قدر الإمكان، ثم إضافة كمية مساوية من وسط تمايز قلبي جديد يحتوي على 10 millimolar من النيكوتيناميد.

امزج أرومات القلب (cardio blasts) العائمة باستخدام الماصة، ثم وزع أربعة ملليلتر من معلق أرومات القلب في كل بئر من أطباق زراعة الأنسجة ذات الستة آبار. انقل الأطباق إلى حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius للسماح لأرومات القلب بالالتصاق بأطباق زراعة الأنسجة طوال الليل. كرر ذلك يوماً بعد يوم أثناء الزراعة.

استبدل وسط التمايز القلبي الذي يحتوي على 10 mM من النيكوتيناميد في اليوم الثامن. انتقل إلى استخدام وسط التمايز القلبي الخالي من النيكوتيناميد، واستمر في استبدال الوسط كل يومين.

خلال أسبوعين من سحب النيكوتيناميد، ستبدأ الخلايا العضلية القلبية النابضة في الظهور ويزداد عددها؛ حيث تبين أن النيكوتيناميد كافٍ لتحفيز خلايا ES البشرية المحفوظة في نظام استزراع محدد للانتقال من الحالة متعددة القدرات حصرياً إلى النمط الظاهري الميزوديرمي القلبي. وعند تعريض خلايا ES البشرية غير المتمايزة للنيكوتيناميد، خضعت جميع الخلايا داخل المستعمرة لتغيرات مورفولوجية تحولت بموجبها إلى خلايا متمايزة كبيرة خفضت من تعبير OCT four. كما بدأت الخلايا في التعبير عن عامل النسخ النوعي للقلب، NK X 2.5، وأيضاً التعبير عن alpha actinin.

تتوافق كلتا الخاصيتين مع النمط الظاهري للأديم المتوسط القلبي. وتستمر هذه الخلايا المتمايزة في التكاثر وزيادة الحجم في مناطق المستعمرات التي تجمعت فيها الخلايا. وأصبح تعبير NKX 2.5 أكثر كثافة. وبعد الفصل، شكلت خلايا ES البشرية المعالجة بالنيكوتيناميد أرومات قلبية في مزرعة معلقة.

بعد السماح للخلايا القلبية (cardio blasts) بالالتصاق، عولجت هذه الخلايا بالنيكوتيناميد لمدة أسبوع واحد، وبعد مرور أسبوع إلى أسبوعين من سحب النيكوتيناميد، بدأت الخلايا العضلية القلبية النابضة في الظهور مع زيادة ملحوظة في الكفاءة. وقد ظهرت على شكل تجمعات خلوية تنبض بانقباضات إيقاعية، بينما لم تظهر هذه الخصائص في التمايز التلقائي متعدد السلالات للخلايا التي لم تخضع لمعاملة IDE. كما أظهرت الخلايا الموجودة ضمن تجمعات الخلايا العضلية القلبية النابضة مؤشرات مميزة للخلايا العضلية القلبية، بما في ذلك NK X 2.5 و alpha actinin.

تم التأكد من أن انقباضات الخلايا العضلية القلبية النابضة كانت قوية وإيقاعية ومنسقة ومتزامنة جيداً من خلال المخططات الكهربائية، حيث أظهرت نبضات منتظمة تذكرنا بمعقدات P-Q-R-S-T التي تظهر من أقطاب سطح الجسم في تخطيط كهربية القلب السريري. وعلاوة على ذلك، استطاعت الخلايا العضلية القلبية الاحتفاظ بقدرتها القوية على الانقباض لأكثر من ثلاثة أشهر. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن استخدامها لإنتاج سلائف قلبية وخلايا عضلية قلبية نابضة بشكل موحد من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية متعددة القدرات في غضون خمسة أسابيع تقريباً إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.