تعيين تباين التعبير البروتين في الأورام باستخدام المناعي الكمي

الهدف العام من التجربة التالية هو التحديد الكمي الدقيق لتعبير المؤشرات الحيوية عبر مقاطع نسيجية كاملة من سرطان بشري، وذلك من أجل تعيين قيمة عددية لدرجة التباين في التعبير البروتيني. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق مسح مقاطع نسيج نسيج سرطاني مُعلم مناعياً فلورياً باستخدام ماسح ضوئي فلوري للشرائح الكاملة. بعد ذلك، يتم اختيار المناطق ذات الأهمية داخل الورم لتقييمها.

ثم يتم قياس تعبير البروتين المستهدف داخل مناطق الورم الغازية باستخدام نظام aqua analysis للتحليل الآلي للصور. وفي النهاية، يمكن استخدام هذه الطريقة لرسم خريطة تعبير المؤشرات الحيوية في أنسجة السرطان، والتي غالبًا ما تكون غير متجانسة للغاية عبر مقطع النسيج. وتكمن الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنيات مقارنة بالطرق التقليدية، مثل الكيمياء النسيجية المناعية التي تستخدم كواشف التصوير اللونية والمترية، في أن التألق المناعي أكثر كمية وأكثر حساسية.

إن الربط بين هذه الطرق التحليلية ومسح القطاعات الكاملة بالفلورة المناعية يتيح رسم خرائط دقيقة للاختلافات الطفيفة في تعبير المؤشرات الحيوية عبر الأنسجة. ولأول مرة، يقوم مارك غوستافسون، مدير العمليات المباشر في مختبر Histo RX، باستعراض هذه الإجراءات. بعد تقطيع خزعة من نسيج سرطاني باستخدام الميكروتوم، وصباغة العينة بالفلورة المناعية للكشف عن تعبير المؤشرات الحيوية المستهدفة، يتم تحميل ما يصل إلى خمس شرائح من القطاعات المصبوغة في كاسيت الشرائح الخاص بجهاز مسح الشرائح.

ثم باستخدام الواجهة في وحدة تحكم مجهر المسح الضوئي (scan scope console)، قم بتحديد منطقة لكل شريحة بحيث تشمل جميع الأنسجة الموجودة على الشريحة، بغض النظر عن نمط الصبغ أو الجوانب الملحوظة الأخرى للعينة. بعد ذلك، وباستخدام وحدة تحكم مجهر المسح الضوئي، حدد أولاً منطقة من النسيج لتقييمها، ويفضل أن تكون ضمن منطقة الورم في النسيج لتقديم أفضل تمثيل ممكن.

باستخدام ميزة التعريض الضوئي التلقائي في وحدة تحكم مجهر المسح (scan scope console)، حدد وقت التعريض لكل قناة بالإضافة إلى بؤرة الصورة؛ استخدم المعين الأزرق في صورة وحدة تحكم مجهر المسح لاختيار منطقة إضافية بعيدة عن النسيج، ولكنها لا تزال ضمن منطقة الشريحة تحت غطاء الشريحة، وذلك لتحديد منطقة الخلفية التي سيتم من خلالها الحصول على صور تصحيح الحقل المسطح (flat field correction). بالنسبة لكل مرشح، أضف نقاط بؤرة إلى منطقة النسيج، والتي تمثلها مربعات صفراء، لتحسين عملية التقاط الصور. إذا ظهر أن الصور تحتوي على خلفية عالية أو شوائب تصويرية أخرى، فيجب نقل منطقة الصورة والتقاط صور جديدة.

يتم بعد ذلك مسح الأنسجة ضوئياً، ثم تُرفع صور الشرائح الرقمية المكتسبة تلقائياً إلى قاعدة بيانات Aperio spectrum. انقر نقراً مزدوجاً فوق الصورة المصغرة في برنامج spectrum لاختيار الشريحة المراد تحليلها من قائمة الشرائح الرقمية في قاعدة بيانات spectrum. ثم استخدم صورة H&E الموضحة المرفقة لتحديد منطقة الاهتمام على الصورة الفلورية.

يمكن تحديد مناطق متعددة ذات أهمية مرسومة بدوائر فردية على عينة واحدة. يتم حفظ الصور المشروحة تلقائيًا في قاعدة بيانات الأطياف. الآن اختر Analyze من شريط القوائم في أعلى الشاشة، وعند ظهور نافذة التحليل، اختر histo RX aqua analysis من القائمة المنسدلة.

عندما تكون مستعداً للبدء، اضغط على زر التحليل. ستظهر نافذة وحدة تحكم مصغرة في شريط مهام Windows تعرض تقدم عملية نقل الصور من قاعدة بيانات Spectrum إلى الكمبيوتر المحلي. وبمجرد نقل البيانات، سيبدأ تشغيل تحليل aqua لإنشاء درجة aqua باستخدام خوارزمية تسجيل aqua غير خاضعة للإشراف تعتمد على تجميع بيانات عتبة العينة الأولى، وهي إشارة صورة pan cytokeratin فوق إشارة صورة الخلفية. سيتيح ذلك استخدام البكسلات لتحديد قناع الورم الذي يمكن استخدامه بعد ذلك في الحسابات اللاحقة.

استخدم بكسلات البان سايتوكيراتين ذات التعبير العالي لتحديد المناطق السيتوبلازمية أو المناطق غير النووية في الخلايا الورمية أيضاً. وكما هو موضح هنا، فإن البكسلات ذات الإشارة العالية في قناة DPI والتي تقع ضمن قناع الورم يتم تحديدها على أنها ذات طبيعة نووية. إذا تم تحديد حقول غير مناسبة للتقييم عند المراجعة بسبب وجود شوائب في العينة أو التصوير، يتم استبعاد تلك الحقول من التقييم وستؤدي أيضاً إلى نتيجة نهائية بالفشل.

تُمثَّل نتائج تسجيل aqua في شكل جدول من الدرجات المرتبطة بكل بلاطة بكسل بمقاس 512 في 512 بكسل ضمن المنطقة ذات الاهتمام في عينة مقطع نسيجي كامل، والتي يمكن حفظها واستخدامها للتحليل الإحصائي اللاحق. وتوضح هذه الصور المجهرية المصبوغة بالهيماتوكسيلين والإيوزين كيف يمكن أن تظهر مناطق مختلفة من نفس سرطان المبيض مورفولوجيا متغيرة. ويسلط العرض عالي التكبير في الجزء العلوي الأيمن من الشكل B الضوء على خلايا ذات تصفية سيتوبلازمية ونمط نمو صلب في الجزء العلوي من الورم.

ومع ذلك، فإن الجزء السفلي من النسيج المكبر في القسم السفلي الأيمن من الشكل C، يتميز بسيتوبلازم حمضي (eosinophilic) أكثر تجانساً ونمط نمو حليمي. وتظهر هنا خرائط حرارية لعدم التجانس في تعبير ER في مقطع نسيجي من سرطان المبيض قبل وبعد العلاج الكيميائي في اللوحين العلوي والسفلي على التوالي. لاحظ التغير من تعبير ER متغير عبر المقطع مع وجود مناطق ذات تعبير مرتفع ومنخفض في الشكل العلوي، إلى توزيع متساوٍ لتعبير ER المرتفع الموضح باللون الأحمر في الشكل السفلي.

يُشار إلى التمثيل العددي لهذا التغيير على اليسار من خلال الانخفاض في مؤشر سيمبسون (Simpsons index). وتظهر في هذا الشكل مرة أخرى الخرائط الحرارية لعدم التجانس لـ HER two في مقطع نسيجي من سرطان المبيض قبل العلاج وبعده، كما هو موضح في اللوحتين العلوية والسفلية على التوالي. يرجى ملاحظة التغيير مجدداً من تعبير HER two المتغير عبر المقطع، مع وجود مناطق ذات تعبير عالٍ ومنخفض في الشكل العلوي، إلى توزيع متساوٍ لتعبير HER two العالي في الشكل السفلي.

ومرة أخرى، يُلاحظ انخفاض مؤشر Simpson. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن جودة البيانات الناتجة عن التحليل الحاسوبي تعتمد كلياً على جودة الصبغة، والتي يجب أن تكون ذات معيار تقني عالٍ.