موازية لوحة الدائرة التدفق المستمر وحلبة لتقييم تدفق الخلايا الاصلية تحت تدفق رقائقي غشائي إجهاد القص

الهدف العام من مقالة الفيديو هذه هو وصف تقنية لإخضاع الخلايا الملتصقة لظروف التدفق الصفحي وتقييم الاستجابة لضغوط قص السوائل القابلة للقياس الكمي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجميع دائرة التدفق أولا بدون غرفة التدفق. تشتمل الدائرة على نبض الخزان ، والمثبط ، والأنابيب الصلبة ، والأنابيب الناعمة ، والديوك التوقف رباعية الاتجاهات ، ومحولات الإغراء المتصلة ، بالإضافة إلى مرشح الهواء.

الخطوة التالية هي ملء الدائرة بثمانية الغزارة المطلوبة ، مثل وسط الخلية في ظل ظروف معقمة ، ثم بدء تشغيل المضخة لملء مخمد النبض وتطهير أنبوب الهواء. يتبع ذلك إدخال شريحة الخلية الجالسة في اللوحة السفلية لغرفة التدفق. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي التجميع الكامل لدائرة التدفق مع غرفة التدفق في الخط.

في النهاية ، يمكن الحصول على النتائج التي تظهر محاذاة الخلايا السلفية البطانية المصنفة بالفلورسنت تحت التعرض لإجهاد قص السوائل من خلال الغرفة الشفافة باستخدام المجهر الفلوري لدراسة السلوك الوظيفي للخلايا. غالبا ما يكون من الضروري تقليد فسيولوجيا في الجسم الحي عن طريق تعريض الخلايا لإجهاد قص السوائل. لقد صممنا غرفة تدفق لوحة متوازية ودائرة تدفق مستمر ، مما يسمح لنا بدراسة الخلايا في ظل ظروف التدفق ومراقبتها من خلال الغرفة الشفافة.

يمكن أن تكون هذه التقنية بمثابة أداة بحث قيمة لمجالات الطب والهندسة. تسمح غرفة التدفق الخاصة بنا بالتصور المتقطع أو في الوقت الفعلي للخلايا قيد التدفق باستخدام المجهر المستقيم أو المقلوب. علاوة على ذلك ، يسمح تصميم الدكتور آتش للباحثين بتصوير الخلايا على الأسطح الشفافة أو الظليل للإشعاع باستخدام عدسات المجهر القياسية.

علاوة على ذلك ، يمكن أن تكون أداة مهمة في أبحاث علم الأدوية لدراسة تأثير الأدوية على الخلايا في ظل ظروف التدفق. يعد تصور الإعداد أمرا بالغ الأهمية لأنه يصعب إتقان العديد من الخطوات من خلال قراءة البروتوكول وحده. سأقدم إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية إعداد غرفة التدفق ودائرة التدفق المستخدمة بشكل شائع في مختبر Dr.Ock Next لتجميع دائرة التدفق.

ابدأ بربط جزء 36 بوصة من الأنابيب الصلبة بأحد طرفي مخمد النبض بالطرف الآخر. قم بإرفاق جزء مقاس 18 بوصة من الأنابيب الناعمة. ضع محول إغراء ذكر بحجم ثماني بوصة في نهاية قسم الأنابيب الناعمة مقاس 18 بوصة.

قم بتوصيل إغراء الذكور بمحول إغراء أنثى بحجم ثمن بوصة. قم بإرفاق الإغراء الأنثوي بجزء جديد مقاس 18 بوصة من الأنابيب الناعمة. حفر ثلاثة ثقوب في غطاء دورق زجاجي سعة 250 مل.

من أجل ملاءمة الأنبوب ، أدخل قطعة 1.5 بوصة من الأنابيب الناعمة في فتحة واحدة. كفتحة تهوية. أدخل الأطراف الحرة للأنبوب الصلب والناعم من خلال الفتحتين الأخريين في الغطاء في الزجاجة سعة 250 مليلتر ، والتي ستكون بمثابة خزان.

تأكد من وصول الأنبوب الصلب إلى قاع الخزان. يعد الحفاظ على العقم في جميع أنحاء إعداد الدائرة أمرا بالغ الأهمية لنجاح هذا الإجراء. لذلك ، يجب تعقيم جميع الأجزاء ويجب عليك ارتداء قفازات معقمة طوال الوقت.

بالإضافة إلى الأجزاء المجمعة ، يجب تعقيم هذه الأجزاء. غرفة تدفق كاملة واحدة ، ثلاث بوصات من الأنابيب الناعمة ، ذكر واحد وأنثى واحدة ، محول إغراء ثامن بوصة ، أربعة براغي مسطحة نصف بوصة ، 6 5 16 بوصة ، ثمانية 30 ثانية. مسارات بوصة في البوصة ، مسامير مسطحة الرأس ، زوج واحد من الملقط ، شريحة زجاجية واحدة ، ومنشفة معقمة بالبخار.

التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ضع غرفة تدفق دائرة التدفق أربعة في أربعة طرق توقف الديوك واحدة تلو الأخرى ، أوقف الديك وجميع الأجزاء المعقمة في هذا الحقل المعقم. أثناء ارتداء قفازات معقمة ، قم بتوصيل قضيبي التوقف رباعي الاتجاهات.

ضع الأغطية على منافذ العينة المفتوحة. افصل محولات الإغراء من الذكور والإناث التي تربط جزأين من الأنابيب الناعمة لدائرة التدفق وأدخل ديوك التوقف المتصلة. قم بتوصيل الأنبوب الناعم الذي تم إدخاله في الخزان في حقنة سعة 30 مليلتر وقم بإزالة مكبس المحقنة.

املأ الزجاجة ب 125 مل من EPC متوسط. أعد توصيل الأنبوب الناعم بقضيب التوقف. ضع مرشح حقنة معقم في فتحة التهوية.

الآن انقل دائرة التدفق إلى حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بتثبيت الأنبوب الصلب في رأس مضخة الأسطوانة المرنة الرئيسية المشار إليها للاستخدام مع هذا النوع من أنابيب الفحم بالمر. تأكد من أن الأنبوب لا يتداخل مع مسارات تركيب مضخة الأسطوانة.

ضع علامة على الأنبوب حيث يخرج من رأس المضخة على كلا الجانبين بقلم وسم. بعد التأكد من إغلاق جميع حواجز التوقف باتجاه منافذ العينة وفتحها على طول دائرة التدفق ، ابدأ تشغيل المضخة. تحقق من اتجاه التدفق.

يجب أن ينتقل PERFUSE ثمانية من الخزان الزجاجي عبر الأنبوب الصلب إلى مخمد النبض. لتجميع غرفة التدفق ، استخدم قفازات معقمة لتوصيل قطعة أنابيب ناعمة بحجم بوصتين بمحول إغراء أنثى بحجم ثمن بوصة. قم بتوصيل جزء آخر من الأنابيب الناعمة بحجم بوصتين بمحول إغراء ذكر بحجم ثمن بوصة.

قم بتوصيل الأنبوب الناعم بوصتين مع محول إغراء أنثوي بمنفذ التدفق والأنابيب الناعمة بوصتين مع محول إغراء ذكر بمنفذ التدفق الخارج. قم بتوصيل ديوك التوقف رباعية الاتجاهات بكل من محولات الإغراء هذه. قم بتوصيل قطعة الأنابيب الناعمة المتبقية بوصتين بموصل المنفذ الجانبي الخارج من مصيدة الفقاعات وقم بإرفاق قضيب إيقاف أحادي الاتجاه باستخدام ملاقط معقمة.

قم بإزالة الشريحة المصنفة للخلية من وعاء زراعة الخلايا وضعها في التجويف على اللوحة السفلية لغرفة التدفق. تأكد من وضع الشريحة بحيث يكون جانب الخلية متجها لأعلى باستخدام حقنة أو ماصة ضع 10 مل من وسط EPC الدافئ فوق الشريحة الموجودة في الخلية. اسمح للوسيط بتغطية الشريحة في غرفة التدفق ، لكن لا تسكب الوسيط فوق الحلقة O على اللوحة السفلية.

ضع اللوحة العلوية لغرفة التدفق على اللوحة السفلية ، وقم بمحاذاة فتحات البراغي. حافظ على اللوحين متوازيين حتى لا تدخل فقاعات الهواء في ألواح برغي الغرفة. معا. باستخدام مفك البراغي التلقائي تعمل بالبطارية دي الهواء فخ فقاعة التدفق عن طريق فتح الديك وقف اتجاه واحد المرفقة بمنفذ فخ الفقاعات الجانب المتدفق.

استخدم حقنة سعة 10 ملليلتر لشطف أنبوب التدفق بلطف بوسيط EPC ثم أغلق قضيب التوقف هذا وقم بتغطيته. الآن de تهوية قناة الغرفة عن طريق فتح منفذ التدفق الخارجي رباعي الاتجاهات وتنظيف وسيط EPC برفق من خلال غرفة التدفق. مرة أخرى باستخدام غطاء حقنة 10 ملليلتر ، قم بإيقاف جميع وصلات الديك رباعية الاتجاهات وإغلاقها.

انقل غرفة التدفق إلى الحاضنة المرطبة باستخدام دائرة التدفق المجمعة. أوقف مضخة دائرة التدفق مؤقتا وأغلق دائرة التدفق. أوقف الديوك في اتجاه التدفق لمنع التسرب.

قم بتوصيل غرفة التدفق بدائرة التدفق بعد توصيل غرفة التدفق بدائرة التدفق ، افتح صغار التوقف في اتجاه التدفق. استأنف مضخة التدفق وتأكد من تدفق PERFUSE ثمانية في الاتجاه الصحيح. اضبط معدل التدفق على الضغط المطلق المطلوب.

أثناء تجربة التدفق ، يمكن إزالة غرفة التدفق من الدائرة لتصوير الخلايا عبر الفحص المجهري الضوئي أو الفلورسنت. للقيام بذلك ، افصل غرفة التدفق عن دائرة التدفق عند قضيب التوقف لإيقاف توصيلات الديك. لجمع ثماني عينات للتحليل.

أولا ، أوقف المضخة مؤقتا ، وأغلق قضيب التوقف الموجود بالقرب من مخمد النبض. قم بإزالة غطاءه الواقي وضعه رأسا على عقب للتأكد من عدم تلوثه. أدخل حقنة صغيرة في منفذ العينة.

أغلق قضيب الإيقاف في اتجاه غرفة التدفق ، مع إبقاء منفذ العينة والدائرة في اتجاه مخمد النبض مفتوحا. اسحب الكمية المطلوبة من العينة من الدائرة ، وأغلق محبس باتجاه منفذ العينة قبل إزالة المحقنة. قم بتخزين العينة الغزيرة في قارورة تحمل علامة وقم بتجميدها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

قم بتلخيص منفذ العينة وتأكد من أن جميع محبس التوقف مفتوح قبل بدء التدفق. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن زرع الخلايا السلفية البطانية المشتقة من الدم البشري على شرائح التيتانيوم في غضون 15 دقيقة وتلتصق بقوى القص الفسيولوجية. كما هو موضح في هذا الشكل ، انتشرت EPCs تحت تأثير التدفق من حوالي 210 ميكرون مربع مباشرة بعد البذر إلى حوالي 657 ميكرون مربع بعد ثلاث ساعات وحوالي 1،152 ميكرون مربع بعد 48 ساعة من إجهاد قص السوائل البالغ 15 طعاما لكل سنتيمتر مربع.

توضح صورة المجهر الضوئي هذه الاتجاه العشوائي ل EPCs البشرية. بعد فترة جلوس ثابتة مدتها ست ساعات بعد ثلاث ساعات من التدفق عند 100 طعام لكل سنتيمتر مربع ، انتشرت الخلايا ولكنها ظلت في اتجاه عشوائي. بعد 48 ساعة من إجهاد قص السوائل عند 100 طعام لكل سنتيمتر مربع ، تتم محاذاة EPCs وتوجيهها في اتجاه التدفق.

هنا تم تصنيف EPCs ب CTO ونواة الخلايا الملطخة بالهركس لتموت بعد التدفق. للمقارنة ، تظهر هذه الصورة EPCs الخنازير على شرائح التيتانيوم بمحاذاة مع اتجاه التدفق. بعد 48 ساعة من التدفق و 15 طعاما لكل سنتيمتر مربع من التعرض لإجهاد القص ، تم تلطيخ حدود الخلية بصبغة مضادة ل PCAM والنوى بصبغة الحمض النووي للسيتوكسين.

تسمح هذه الطريقة أيضا بالحصول على عينات من PERFUSE ثمانية في نقاط زمنية محددة مسبقا لتحليل و / أو القياس الكمي لمستقلبات الخلايا المفرزة. يظهر هنا مثال على إنتاج النتريت خلال تجربة تدفق لمدة 48 ساعة مع EPCs الخنازير. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على العقم طوال الوقت.

بالإضافة إلى ذلك ، من المهم اتخاذ الخطوات اللازمة لتقليل عدد فقاعات الهواء في غرفة التدفق قبل بدء التدفق المستمر لأنها قد تمزق الخلايا. نوصي أيضا بفحص كل اتصال في غرفة التدفق والدائرة قبل الوفرة لمنع تسرب PERFUSE ثمانية أثناء التجربة. تم تصميم هذه الغرفة بحلقات O مدمجة تسمح بمعارضة كاملة للألواح العلوية والسفلية وتوفر ختما مانعا للتسرب دون الحاجة إلى مضخات تفريغ.

تضمن هذه الميزة أيضا ارتفاعا ثابتا للغرفة بين التجارب وتلغي الحاجة إلى حشوات مطاطية أو تعديلات. تستخدم غرفة التدفق الخاصة بنا شرائح مجهر موحدة. لذلك ، يتوفر عدد كبير من الخلايا لمزيد من التجارب.

على سبيل المثال ، يمكن تقييم الحمض النووي الريبي والحمض النووي من الخلايا بعد التدفق لتخليق البروتين أو التعبير الجيني. يسمح تصميم الدائرة لدينا بجمع ثماني عينات لتحليل وقياس مستقلبات الخلية مثل النتريت ، وهو مستقلب مؤكسد أولي لأكسيد النيتريك ، والذي تفرزه الخلايا تحت إجهاد قص السوائل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع غرفة التدفق ودائرة التدفق المعقمة لإخضاع خلايا الالتصاق بإجهاد قص السوائل.