تمتد سلاسل قصيرة من الحمض النووي مع ثابت القوة المحورية الملقط البصري

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحكم في جزيئات DNA قصيرة بطول 100 نانومتر باستخدام قوى بصرية ثابتة ومعايرة بدقة. ويتم تحقيق ذلك عن طريق ربط أحد طرفي جزيء DNA بشريحة غطاء، والطرف الآخر بكرة مجهرية من البوليسترين. بعد ذلك، يتم محاذاة الملاقط البصرية ومعايرتها.

بعد ذلك، يتم سحب الحمض النووي DNA بعيداً عن السطح من خلال مجموعة من قوى التدرج وقوى التشتت المؤثرة على الكرة المجهرية. وأخيراً، يتم بسط الـ DNA عن طريق حبس الخرزة في المنطقة الخطية للجهد. وقد استُخدم هذا البروتوكول لدراسة الخصائص الميكانيكية للـ DNA وحركية ارتباط البروتين بالـ DNA، كما كان مفيداً في توضيح أهمية الشروط الحدية على مرونة تركيبات DNA القصيرة.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن محاذاة ومعايرة الملاقط الضوئية ذات القوة الثابتة صعبة ومعقدة. تتضمن الملاقط الضوئية شعاعاً من ليزر بطول موجي 1064 nanometer ينقسم إلى شعاعين متعامدي الاستقطاب؛ يُستخدم أحدهما للتحكم في الجزيء الحيوي، بينما يُستخدم الآخر لأغراض المعايرة.

يتم التحكم في شدة شعاع المعالجة بواسطة عاكس بصري صوتي (AO optic deflector) أو عاكس بصري (OD). ثم يتم إعادة دمج الأشعة باستخدام مقسم أشعة مستقطب آخر. يتم تركيز الأشعة بدقة على خلية العينة بواسطة عدسة شيئية مجهرية زيتية من نوع plan APO 60 x 1.4. يدمج إعداد الملقط هذا مع مجهر حقل مضيء مُصنع محلياً، والذي يوفر إضاءة من مصباح هالوجين يتم تركيزها على غرفة العينة بواسطة مكثف.

يتم فصل صورة المجال المضيء عن ضوء الليزر بواسطة مرآة ثنائية اللون، ثم يتم تصويرها بواسطة كاميرتين من نوع CCD. تعمل إحدى كاميرات CCD كوسيلة أساسية لجمع البيانات، ويتم تحفيزها برمجياً لضمان الحصول على معدلات أخذ عينات دقيقة. بينما تُستخدم كاميرا CCD الأخرى لتصوير كرة مجهرية مرجعية واحدة ثابتة، حيث يعمل موضعها كنظام تحكم بالتغذية الراجعة للتعويض عن الانزياح في المجهر.

يتم وضع العينة بشكل تقريبي بالنسبة للعدسة الشيئية بواسطة منصة XY، ومن ثم يمكن تحديد موقعها بدقة عبر منصة بيزو (piso) مدمجة ثلاثية الأبعاد. يتم تجميع ضوء الليزر المشتت للأمام والنافذ بواسطة مكثف المجال الساطع وتركيزه على كاشف ضوئي لمعايرة حجم الخرزة، ثم يتم ملء غرفة العينة بمحلول مشتت من كرات البوليسترين الدقيقة بقطر 800 nanometer والمخففة في محلول ملحي منظم بالفوسفات. تُترك العينة لمدة 10 إلى 15 دقيقة ثم تُشطف برفق باستخدام المحلول المنظم.

لإزالة الكرات المجهرية الزائدة، حدد موقع كرة مجهرية ملتصقة عشوائياً بالزجاج الغطائي واضبط ارتفاع حجرة العينة حتى تصبح الكرة المجهرية تحت مستوى التركيز بحوالي 1 µm. ولإنشاء صورة غير مركزة لقياس الحجم الظاهري للصورة باستخدام lab view، ابحث أولاً عن مركز الكرة المجهرية باستخدام وظيفة مطابقة الأنماط الهندسية. بعد ذلك، أنشئ ملفاً تعريفياً شعاعياً لشدة إضاءة الكرة المجهرية عن طريق حساب المتوسط لـ 360 درجة.

حول مركز كل مقطع عرضي، يتم مطابقة المقطع الشعاعي، والذي يتوافق مع حلقة بيضاء في كل صورة من صور الحقل المضيء، باستخدام دالة تربيعية. ولتحديد ذروة السطوع، يمكن استخدام المسافة بين هذه الذروة والمركز كمقياس للحجم الظاهري للخرزة. باستخدام منصة piso المعايرة، يتم زيادة الموضع المحوري للكرة المجهرية تدريجياً والتقاط صورة عند كل موضع محوري بواسطة كاميرا CCD. تُكرر عملية تحليل الصور لكل صورة متتالية لربط الحجم الظاهري للكرة المجهرية بموقعها المحوري.

تبلغ الدقة المحورية التي تم الحصول عليها بواسطة هذه الطريقة حوالي 1.4 nanometers؛ ولرسم خريطة الجهد البصري لشعاع التحكم، ابدأ بمحاذاة شعاع التحكم وشعاع المعايرة مع إيقاف تشغيل شعاع التحكم. قم بحجز كرة مجهرية حرة داخل المصيدة الأكثر صلابة بكثير الخاصة بشعاع المعايرة، ثم قم بتشغيل شعاع التحكم.

نظراً لأنها أضعف بكثير من شعاع المعايرة، فإن الموضع المحوري للميكروسفير سيتعرض لاضطراب طفيف. ويمكن قياس التغير الناتج في الموضع المحوري من صور المجال المضيء غير المركزة كما تم وصفه سابقاً. قم بإزاحة التركيز المحوري وكرر العملية، ثم ارسم مخططاً لإزاحة delta X مقابل الموضع المحوري لبؤرة شعاع المعايرة.

يحدد الموضع المحوري المقابل لأكبر إزاحة للميكروسفيير مركز المنطقة الخطية للمصيدة الضوئية. ولمط جزيئات DNA، يتم تركيب الغرفة التي تحتوي على جزيئات DNA المربوطة بالسطح، وأثناء مراقبة صورة المجال المضيء، يتم وضع بؤرة شعاع التحكم فوق الميكروسفييرات غير الممدودة قليلاً عن طريق ضبط التلسكوب، ثم يتم ضبط موضع المنصة حتى يتم اصطياد أحد الميكروسفييرات. يتم وضع الميكروسفيير تقريبياً في مركز المستوى XY للمصيدة الضوئية، ثم يتم توليد سلسلة من الموجات المربعة في برنامج LabVIEW وإرسالها إلى A OD لتشغيل وإطفاء شعاع الليزر بشكل متكرر.

راقب الكرة المجهرية أثناء تشغيل وإيقاف المصيدة بشكل متكرر. ولاحظ ما إذا كان الليزر يحفز أي اتجاه تفضيلي لحركة الكرات المجهرية أثناء الضبط التكراري لموضع الكرة المجهرية في كلا اتجاهي X و y. ومن خلال التحكم في منصة piso، يجب أن تصبح الحركة العشوائية للكرة المجهرية متماثلة المناحي في المستوى X five، رغم أنها تكون مقيدة بشكل ملحوظ عند تشغيل الليزر.

بعد ذلك، قم بمحاذاة الخرزة في الاتجاه Z. قم مرة أخرى بتشغيل وإيقاف شعاع الليزر بشكل نبضي، مع قياس الإزاحة المحورية للميكروسكيرات في الوقت الفعلي في آن واحد هذه المرة.

قم بتمركز المسرح ضمن المنطقة الخطية، وهي النقطة التي تكون فيها إزاحة Z أكبر عند تمديد منحدر DNA، ثم حدد شدة الليزر عن طريق إرسال إشارة جهد إلى A OD من صفر فولت إلى 0.5 فولت بخطوات قدرها 0.025 فولت في كل خطوة. سجل 400 إطار بمعدل 100 إطار في الثانية وقم بحساب متوسطها للحصول على الإزاحة المحورية. وأخيراً، ارسم منحنيات القوة والتمدد وقم بمطابقتها مع نموذج السلسلة الشبيهة بالدودة المعدل.

تظهر هنا منحنيات القوة والمط لسلاسل NA ثنائية الأبعاد، بطول 1 و298 زوجاً قاعدياً و247 زوجاً قاعدياً لمقاطع قصيرة من DNA. لا يفسر نموذج السلسلة الشبيهة بالدودة (WLC) التقليدي العلاقة بين القوة والمط بشكل كامل، لأنه عند هذه المقاييس الطولية، يجب مراعاة تأثيرات الحجم المحدود والمط عند قوة صفرية الناتج عن قيود الحدود. وبناءً على ذلك، يجب مطابقة قياسات القوة والمط باستخدام نموذج WLC معدل، يتضمن طول استمرار فعال ومط عند قوة صفرية كمعاملات مطابقة موصوفة بالتفصيل في المواد التكميلية.

بالنسبة لأطوال الخطوط الكنتورية الكبيرة من D-S-D-N-A، يكون طول الاستمرار الفعال هو ببساطة طول الاستمرار الاسمي الذي يبلغ حوالي 50 nanometers، ويمكن إهمال تمدد القوة الصفرية من ملاءمات WLC المعدلة. تبلغ أطوال الاستمرار الفعالة 35 nanometers للحمض النووي DNA المكون من 298 base pair، و 25 nanometers للحمض النووي DNA المكون من 247 base pair بعد تطويره. وقد مهدت هذه الطريقة الطريق لمجموعة من القياسات الميكانيكية النانوية على DNA ومعقدات DNA والبروتين، بما في ذلك دراسة حركية تكوين وتفكك حلقات DNA التي تتوسطها البروتينات التنظيمية.