توصيف بالسكان خلية كهربية من GFP - يعرب عن السليمة في الشبكية

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة الاستجابات الضوئية ومورفولوجيا العصبونات المفردة في الشبكية السليمة، وذلك باستخدام سلالة من الفئران تعبر عن علامة فلورية حصرياً في أنواع خلوية محددة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح العين للحصول على شبكية معزولة. والخطوة الثانية هي وضع الشبكية تحت مجهر مسح ليزري وتصوير خلية عبر الإثارة بالأشعة تحت الحمراء ثنائية الفوتون.

تُستخدم بعد ذلك ماصة دقيقة (micro pipette) للحصول على تكوين تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (whole cell patch clamp) من أجل التسجيل وملء الصبغة. وفي النهاية، يتيح هذا التحضير تسجيل الاستجابات الخلوية للتحفيز الضوئي ويكشف عن مورفولوجيا الخلية المسجلة بواسطة المجهر البؤري (confocal microscopy). وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تسجيل تثبيت الرقعة غير الموجه من الشبكية، في إمكانية توجيه التسجيل بصرياً نحو خلية معلمة فلوروسنتياً دون تحفيز الشبكية بضوء الإثارة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في أبحاث الشبكية، مثل ما هي مساهمة مجموعة خلوية معينة في معالجة المعلومات البصرية؟ وذلك حتى لو كانت المجموعة الخلوية ذات كثافة منخفضة ولا تحمل أي سمات مورفولوجية مميزة قد تسهل عملية التعرف عليها. ابدأ هذه التجربة بتكييف الفأر في الظلام لمدة ثلاث ساعات على الأقل قبل بدء التجربة.

في هذه الأثناء، قم بتحضير المحلول خارج الخلوي كما هو موضح في المخطوطة المرفقة وقم بفقاعته بالكربوجين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بتضحية الفأر واستخرج النوى من العينين باستخدام مقص قزحية منحني. ثم انقلهما إلى طبق يحتوي على المحلول خارج الخلوي.

بعد ذلك، ضع العين تحت مجهر تشريحي مع استخدام مقصات زنبركية. قم بإزالة القرنية والجسم الهدبي عن طريق فتح كرة العين على طول الحافة المسننة. استخرج العدسة وافصل الشبكية بعناية عن الظهارة الصباغية.

بعد ذلك، اقطع العصب البصري بين الشبكية والظهارة الصبغية. ثم أزل الشبكية من كأس العين. لاحظ أن الجانب الداخلي للشبكية الملتفة هو جانب الخلايا العقدية.

الجانب الخارجي هو جانب المستقبلات الضوئية. بعد ذلك، قم بإزالة الجسم الزجاجي من سطح الشبكية الداخلي عن طريق سحبه برفق بمساعدة عود خشبي. ثم قم بعمل شقوق قصيرة على طول محيط الشبكية لتسهيل تسطيح النسيج.

بعد ذلك، انقل الشبكية إلى غرفة التسجيل بحيث يكون جانب المستقبلات الضوئية لأسفل. قم بفردها على القاع الزجاجي باستخدام فرشاة ناعمة وثبتها بإطار من الفولاذ المقاوم للصدأ مشدود بخيوط النايلون. ضع غرفة التسجيل في الظلام تحت مجهر مسح ليزري رأسي.

قم بإجراء تروية فائقة ومستمرة للتحضير الشبكي بمعدل لا يقل عن 5 mL لكل دقيقة. وباستخدام محلول خارج خلوي مؤكسج بالـ car ومسخن إلى 35 °C، يتم وضع المجهر على طاولة هوائية ممتصة للصدمات داخل قفص فاراداي. وللحماية الإلكترونية، قم بتغطية القفص بستارة غير شفافة للحفاظ على التحضير في الظلام.

نقوم أيضاً بحجب الضوء المنبعث من شاشات الكمبيوتر باستخدام رقائق شفافة حمراء. يتم ضبط الليزر تحت الأحمر على طول موجي يتراوح بين 850 و870 نانومتر أو أطوال موجية أطول. يتم الانتقال إلى وضع القفل النمطي (mode locked) واستخدام إثارة الفوتونين لتصوير الخلايا التي تعبر عن GFP.

لتسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp)، املأ الماصات الدقيقة المصنوعة من زجاج البورسليكات بالمحلول داخل الخلوي الذي يحتوي على مسبار فلوري كما هو موضح في المخطوطة المرفقة. ثم أدخل الماصة الدقيقة في الحامل. تأكد من أن القطب المرجعي في حالة تلامس مع المحلول خارج الخلوي في غرفة التسجيل.

بعد ذلك، يتم تسليط الضغط بواسطة الماصة الدقيقة على الخلية المستهدفة التي تعبر عن GFP باستخدام عدسة شيئية غمر مائي بقوة تكبير 40 ضعفاً. تقع أجسام خلايا Omicron في طبقة الخلايا العقدية وكذلك في الجزء القريب من الطبقة الداخلية الشبكية؛ وقبل أن تتلامس الماصة الدقيقة مع الخلية المستهدفة، يجب اختراق الغشاء المحدد الداخلي عند سطح الشبكية. ويُستدل على نجاح الاختراق من خلال خروج المحلول داخل الخلوي من طرف الماصة الدقيقة وانفصال الغشاء المحدد الداخلي عن أنسجة الشبكية الموجودة تحته. ويمكن للصبغة الفلورية الموجودة في المحلول داخل الخلوي أن تكشف عن موضع الماصة الدقيقة في صورة الفوتونين أثناء الاقتراب من الخلية المطلوبة.

بعد ذلك، حرّر الضغط من الماصة الدقيقة (micro pipette) للحصول على تهيئة تثبيت الرقعة للخلية الكاملة (whole cell patch clamp). وفي وضع تثبيت التيار (current clamp mode)، يجب أن يعطي التسجيل القابل للاستخدام جهد غشائي يتراوح بين -50 إلى -55 millivolts ويستمر لمدة 20 دقيقة على الأقل. بعد ذلك، قدّم المحفزات البصرية التي تم إنشاؤها على شاشة الكمبيوتر.

قم بضبط شدة التحفيز عن طريق إدخال مرشحات الكثافة المحايدة في مسار الشعاع، واضبط الموضع المكاني للتحفيز ليكون في مركز الخلية المسجلة. بعد ذلك، ابدأ بروتوكول التحفيز وسجل الاستجابات الضوئية. استخدم مولد المحفزات لتشغيل برنامج التسجيل.

ضع ثنائياً ضوئياً ضمن مسار الشعاع لتسجيل توقيت التحفيز. توخ الحذر لضمان عدم سحب جسم الخلية عند تراجع الماصة الدقيقة. وعند الانتهاء من ملء الصبغة، اترك العامل الفلوري ينتشر داخل الخلية المسجلة لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة.

إليك مثال للخلايا التي تعبر عن GFP في تحضير مسطح للشبكية تحت تأثير المحفز الخاص بها. بالنسبة لإنزيم tyrosine hydroxylase، يمكن تمييز مجموعتين بناءً على شدة إشارة GFP. تعبر خلايا الدوبامين من النوع الأول الموجودة في الطبقة بين الخلوية عن فلورة ضعيفة كما توضح رؤوس السهام في الشكل A. أما خلايا النوع الثاني فقد تم وسمها بكثافة وتوجد أجسام خلاياها إما في الطبقة كما توضح السهام في الشكل A أو مزاحة في طبقة الخلايا العقدية كما يظهر في الشكل B، ويوضح الشكل C التطبّق الشجيري لخلايا النوع الثاني في الطبقة الثالثة من الطبقة الضفيرية الداخلية، ويظهر هنا مثال لشكل خلية من النوع الثاني تم حقنها بمقتف neuro biotin.

تمت رؤية الكاشف لاحقاً عن طريق الربط بـ streptavidin المسمى فلوريسنتياً، والذي يظهر هنا باللون الأرجواني. تظهر هنا أنماط استجابة مختلفة لخلية من النوع الثاني تقع في طبقة الخلايا العقدية تجاه الضوء الأبيض. استُخدم محفز مطول لمدة ثلاث ثوانٍ لتحقيق تمييز أفضل لمكونات الاستجابة عند بداية التحفيز، وأثناءه، وعند انتهائه بعد اتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل التجارب الدوائية، أو التصوير الكالسيومي، أو الكيمياء المناعية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل الدور الوظيفي لنوع معين من الخلايا في دوائر الشبكية.