Name: الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: اكتشف طريقة قياس مباشر لنشاط كيناز الخلات في اتجاه تشكيل الخلات باستهلاك فوسفات الأسيتيل. تُحدد المعادلات الحركية للإنزيم وتُطبق على إنزيمات أخرى تستخدم فوسفات الأسيتيل.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل الجائزة NSF # 0920274 وجنوب كارولينا تجربة مشروع محطة (SC - 1700340) لKSS. هذه الورقة التقنية رقم 5929 من المساهمة في تجربة جامعة كليمسون محطة.

<ol><li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins%2C+sugar+kinases%2C+actin%2C+and+hsp70+heat+shock+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).</li>
<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+evolution+of+similar+enzymatic+function+on+different+protein+folds%3A+the+hexokinase%2C+ribokinase%2C+and+galactokinase+families+of+sugar+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases.</a> Protein Sci. 2, 31-40 (1993).</li>
<li>Buss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urkinase%3A+structure+of+acetate+kinase%2C+a+member+of+the+ASKHA+superfamily+of+phosphotransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases.</a> J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).</li>
<li>Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sugar+kinase%2Fheat+shock+protein+70%2Factin+superfamily%3A+implications+of+conserved+structure+for+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).</li>
<li>Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+ATP-binding+fold+in+actin%2C+hexokinase+and+Hsc70%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70.</a> Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).</li>
<li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetate+kinase%3A+not+just+a+bacterial+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Acetate kinase: not just a bacterial enzyme.</a> Trends. Microbiol. 14, 249-253 (2006).</li>
<li>Aceti, D. J., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+acetate+kinase+from+acetate-grown+Methanosarcina+thermophila.+Evidence+for+regulation+of+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of acetate kinase from acetate-grown Methanosarcina thermophila. Evidence for regulation of synthesis.</a> J. Biol. Chem. 263, 15444-15448 (1988).</li>
<li>Latimer, M. T., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+sequence+analysis%2C+and+hyperexpression+of+the+genes+encoding+phosphotransacetylase+and+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).</li>
<li>Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+histidines+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).</li>
<li>Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutational+analysis+of+active+site+residues+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).</li>
<li>Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+transition+state+analog%2C+MgADP-aluminum+fluoride-acetate%2C+in+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).</li>
<li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li>
<li>Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+kinetic+analyses+of+arginine+residues+in+the+active+site+of+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).</li>
<li>Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase+mechanism+by+fluorescence+quenching%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching.</a> Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).</li>
<li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetate+kinase+%28pyrophosphate%29.+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li>
<li>Fowler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+and+structural+characterization+of+the+novel+PPi-dependent+acetate+kinase+from+the+parasite+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica.</a> , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lipmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+synthesis+of+acetyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic synthesis of acetyl phosphate.</a> J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).</li>
<li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. Chem. 159, 21-28 (1945).</li>
<li>Lipmann, F., Jones, M. E., Black, S., Flynn, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+ATP-CoA-acetate+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol.+Suppl%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the ATP-CoA-acetate reaction.</a> J. Cell. Physiol. Suppl. 41, 109-112 (1953).</li>
<li>Rose, I. A., Grunberg-Manago, M., Korey, S. F., Ochoa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+phosphorylation+of+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enzymatic phosphorylation of acetate.</a> J. Biol. Chem. 211, 737-756 (1954).</li>
<li>Allen, S. H., Kellermeyer, R. W., Stjernholm, R. L., Wood, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+enzymes+involved+in+the+proponic+acid+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation.</a> Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).</li>
<li>Clarke, P. M., Payton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymatic+assay+for+acetate+in+spent+bacterial+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants.</a> Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).</li>
<li>Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+assay+of+acetate+kinase+activity%3A+measurement+of+inorganic+phosphate+release+generated+by+hydroxylaminolysis+of+acetyl+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate.</a> Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).</li>
<li>Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+acetate+kinase+from+Bacillus+stearothermophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus.</a> J. Biochem. 84, 193-203 (1978).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الكشف عن الفوسفات الاسيتيل في هذا الاختبار يعتمد على تركيز كاف من هيدروكلوريد هيدروكسيل والتركيز والحموضة من محلول كلوريد الحديديك. وتغيير حجم مقايسة تتطلب إعادة النظر في كل من هذه المكونات. ردود الفعل الأنزيمية الموصوفة هنا أجريت في 37 درجة مئوية مع انتهاء تنفيذ هيدروكسيل عند 60 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ارتفاع درجة الحرارة هذا أمر حاسم للسماح للتحويل السريع للفوسفات في الاسيتيل المتبقية hydroxamate الاسيتيل. توقيت لون الخطوة التنمية وقياس الامتصاصية هو أقل أهمية ، ويمكن أن يؤديها...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td width="160"> اسم الكاشف </td><td width="108"> شركة </td><td width="134"> فهرس العدد </td><td width="103"> تعليقات </td></tr><tr><td> الاسيتيل الفوسفات </td><td> سيغما الدريتش </td><td> 01409 </td><td> ملح الليثيوم (97 ٪) </td></tr><tr><td> فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (يذوى) </td><td> ThermoFisher </td><td> S381 </td><td></td></tr><tr><td> ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم (اللامائية) </td><td> ThermoFisher </td><td> S374 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد المغنيسيوم (hexahydrate) </td><td> ThermoFisher </td><td> M33 </td><td></td></tr><tr><td> قاعدة تريس </td><td> ThermoFisher </td><td> B152 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الحديديك (hexahydrate) </td><td> ThermoFisher </td><td> I88 </td><td></td></tr><tr><td> حمض التريكلوروسيتيك حمض </td><td> ThermoFisher </td><td> A324 </td><td></td></tr><tr><td> هيدروكسيل هيدروكلوريد </td><td> ThermoFisher </td><td> H330 </td><td></td></tr><tr><td> ثنائي فسفات الأدينوزين 5&#39; - ملح الصوديوم </td><td> سيغما الدريتش </td><td> A2754 </td><td></td></tr><tr><td> Biomate الثالث الطيف </td><td> ThermoFisher </td><td> 142982082 </td><td> مستوى الأشعة فوق البنفسجية / معمل فيس </td></tr></table>

الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

كيناز خلات ، عضوا في لخلات والسكر كيناز - Hsp70 - الأكتين فوق الفصيلة انزيم (ASKHA) 1-5 ، هو المسؤول عن الفسفرة عكسها من خلات لاستغلال الفوسفات ATP الاسيتيل باعتبارها الركيزة. كاينيسات خلات موجودة في كل مكان في البكتيريا وجدت في أحد من جنس الأركيا ، وموجودة أيضا في الميكروبات من حقيقيات النوى 6. وتتميز معظم كيناز خلات جيدا هو أن من thermophila المنتجة للغاز الميثان Methanosarcina archaeon 7-14. وقد تم عزل وكيناز خلات التي تستطيع الاستفادة منها فقط PP ط ولكن ليس للاعبي التنس المحترفين في اتجاه تشكيل الاسيتيل الفوسفات من نسج المتحولة ، والعامل المسبب للمرض الزحار الأميبي ، وحتى الآن فقط تم العثور على 15،16 في هذا جنس. في اتجاه تشكيل الفوسفات الاسيتيل ، ويقاس عادة خلات النشاط كيناز باستخدام مقايسة hydroxamate ، وصف لأول مرة من قبل Lipmann17-20 ، ومقايسة يقترن التي يقترن تحويل ATP إلى ADP للأكسدة NADH إلى NAD + من كيناز البيروفات الانزيمات واللاكتات نازعة 21،22 ، أو فحص قياس الافراج عن الفوسفات غير العضوية بعد رد فعل للمنتج الفوسفات الاسيتيل مع هيدروكسيل 23. النشاط في المقابل ، يقاس خلات تشكيل الاتجاه اقتران تشكيل ATP من ADP في الحد من NADP + إلى NADPH من هيكسوكيناز الانزيمات والجلوكوز 6 فوسفات نازعة 24. نحن هنا وصف طريقة للكشف عن النشاط كيناز خلات في اتجاه تشكيل خلات التي لا تتطلب اقتران الانزيمات ، ولكن بدلا من ذلك على ويستند تقرير المباشر للاستهلاك الفوسفات الاسيتيل. بعد رد الفعل الأنزيمية ، يتم تحويل الفوسفات الاسيتيل المتبقية لمجمع الحديد hydroxamate التي يمكن قياسها spectrophotometrically ، أما بالنسبة للمقايسة hydroxamate. وهكذا ، خلافا للشارعandard مقايسة بالإضافة لهذا الاتجاه الذي يعتمد على إنتاج ATP من ADP ، ويمكن استخدام هذا الاختبار المباشر لتحركات خلات التي تنتج ATP أو PP ط.

يوصف أسلوب لتحديد النشاط كيناز خلات. هذا الاختبار يستخدم لتحديد رد الفعل المباشر لنشاط إنزيم وحركية كيناز خلات في اتجاه تشكيل خلات مع يقبلون فسفوريل مختلفة. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لمعايرة الفوسفات الاسيتيل أخرى أو أسيتيل التميم استخدام الانزيمات.

يعد إنزيم أسيتات كيناز (Acetate kinase)، وهو عضو في العائلة الفائقة لإنزيمات أسيتات وسكر كيناز-Hsp70-أكتين (ASKHA) 1-5، مسؤولاً عن الفسفرة العكسية لـ ...

تهدف هذه التجربة إلى القياس المباشر لنشاط تكوين الأسيتات لإنزيم أسيتات كيناز. ابدأ التفاعل بإضافة الإنزيم إلى خليط تفاعل يحتوي على أسيتيل فوسفات وركائز DP. بعد ذلك، أضف هيدروكلوريد الهيدروكسيلامين لتحويل أسيتيل الفوسفات المتبقي إلى أسيتيل هيدروكسيلات.أضف محلول التحميض لتحويل أسيتيل هيدروكسيلات إلى معقد هيدروكسيلات الحديديك الملون الذي يمكن قياسه. تتيح النتائج المستندة إلى القياس الطيفي الضوئي لكمية ركيزة أسيتيل الفوسفات المستهلكة في التفاعل تحديد معاملات حركية الإنزيم. تكمن ميزة هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أنها تعتمد على القياس المباشر لاستهلاك أسيتيل الفوسفات بدلاً من ربط إنتاج TP باختزال ADP. ونظراً لأن هذا المقايسة لا تعتمد على إنتاج TP، فيمكن استخدامها لمجموعة جديدة من كاينيزات الأسيتات التي تنتج فوسفات غير عضوي بدلاً من TP. ولإعداد منحنى قياسي من ست إلى ثماني نقاط، خفف المحلول المخزون من أسيتيل الفوسفات في 100 millimolar triss وصولاً إلى حجم عينة نهائي قدره 300 µL، مع تضمين عينة ضابطة بدون أسيتيل الفوسفات، ثم قم بموازنة جميع العينات في كتلة تسخين عند 37 °C لمدة دقيقة واحدة.الآن، أضف 50 µL من هيدروكسيلامين هيدروكلوريد بتركيز 2 M، واخلط عن طريق الرج ثلاث مرات، ثم حضّن العينات في كتلة تسخين عند 60 °C لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول الإظهار واخلط عن طريق الرج ثلاث مرات، واترك اللون يتطور لمدة دقيقة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. قم بطرد العينات مركزياً باستخدام كوفيتات بلاستيكية مخصصة لجهاز المطياف الضوئي.قِس العينات عند 540 نانومتر. انتقل بعد ذلك لإنشاء منحنى قياسي للامتصاصية عند 540 نانومتر مقابل ميكرومول من أسيتيل الفوسفات باستخدام برمجيات تحليل البيانات والرسم البياني المناسبة. احسب قيمة r squared.وزع حصصاً حجمها 300 µL من خليط التفاعل في أنابيب طرد مركزي دقيقة. تذكر تضمين تفاعل ضابط بدون إنزيم، ثم قم بموازنة الأنابيب لمدة دقيقة واحدة عند 37 °C. في حال إجراء تفاعلات متعددة، أضف الإنزيم إلى الأنابيب في فواصل زمنية محددة وأعد كل أنبوب فوراً إلى الكتلة الحرارية عند 37 °C.بعد خمس دقائق، أضف 50 µL من هيدروكسيلامين هيدروكلوريد بتركيز 2 M، ثم اخلط المزيج واحضه لمدة خمس دقائق عند 60 °C. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول الإظهار، واخلطه واتركه في درجة حرارة الغرفة حتى يتطور اللون. ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 18,000 ×g لمدة دقيقة واحدة.باشر بقياس الامتصاصية عند 540 نانومتر. حدد كمية أسيتيل الفوسفات الموجودة من خلال المقارنة بمنحنى أسيتيل الفوسفات القياسي. يمكن تمثيل البيانات بيانياً ومطابقتها مع معادلة McKayla Cementin لتحديد المعاملات الحركية.يحدد هذا المقايسة استهلاك مادة ركيزة أسيتيل الفوسفات لقياس نشاط إنزيم أسيتات كيناز في اتجاه تكوين الأسيتات. يتم تحويل أسيتيل الفوسفات المتبقي بعد وقت محدد خلال التفاعل الإنزيمي إلى أسيتيل أوكسيبات، ومن ثم إلى معقد هيدروكسي أسيتات الحديديك، والذي يتميز بلون محمر يمكن قياسه عند 540 نانومتر. يمتلك منحنى المعايرة القياسي النموذجي الذي يمثل الامتصاصية عند 540 نانومتر مقابل ميكرومول من أسيتيل الفوسفات ميلاً قدره 1.2332 وحدة امتصاصية لكل ميكرومول من أسيتيل الفوسفات.تشير قيمة r squared الناتجة والتي بلغت 0.99 إلى أن البيانات تتوافق جيداً مع المعادلة الخطية كما هو موضح هنا. يمكن استخدام هذا المقايسة لتحديد قيمة KM لـ acetyl phosphate لمحضرات إنزيمية مختلفة. عند تركيز 5 millimolar من DP مع تركيزات متفاوتة من acetyl phosphate، يتبع إنزيم acetate kinase المأشوب المنقى من methanol Sarina thermophilic حركية McKayla cementin القياسية لكل ركيزة، مما يؤدي إلى قيمة KM ظاهرة تبلغ 0.27 ± 0.01 millimolar من acetyl phosphate.على عكس المقايسة المقترنة القياسية، يمكن لهذه المقايسة المباشرة قياس نشاط كينازات الأسيتات التي تستخدم ركائز أخرى غير TP. فعلى سبيل المثال، عند استخدام أسيتيل الفوسفات بواسطة كيناز الأسيتات في *E. histolytica* المنتج للبيروفوسفات، تم استبدال DP بفوسفات الصوديوم في خليط التفاعل. يشير المنحنى الناتج إلى قيمة KM ظاهرة تبلغ 0.50 ± 0.006 millimolar من أسيتيل الفوسفات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك تصور جيد عن كيفية قياس نشاط كيناز الأسيتات بشكل مباشر عن طريق تحديد كمية أسيتيل الفوسفات المستهلكة.يتمثل العامل الرئيسي في الحصول على نتائج قابلة للتكرار في الحفاظ على الاتساق في كل خطوة، خاصة عند إضافة الإنزيم وفي خطوة الخلط.

direct-detection-acetate-forming-activity-enzyme-acetate

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يصف هذا البروتوكول الخطوات المطلوبة لتنفيذ فحوصات إزالة الأسيتيل في المختبر وفي الجسم الحي من أجل تحديد دور البروتينات كركائز إزالة الأسيتيل المحددة للسيرتوينات ودراسة دور أستلة اللايسين العكسية كتعديل ما بعد الترجمة.

Deacetylation فحوصات لكشف تفاعل بين Sirtuins (SIRT2) ومحددة البروتين ركائز

يقدم هذا العمل طريقة للفحص عالي الإنتاجية باستخدام نظام فحص إنزيم جيني عالمي يمكن تطبيقه نظريا على أكثر من 200 إنزيم. هنا ، يحدد نظام الفحص الفردي ثلاثة إنزيمات مختلفة (الليباز ، السليلوز ، والفوسفاتيز القلوي) ببساطة عن طريق تغيير الركيزة المستخدمة (أسيتات p-nitrophenyl ، p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ، وفوسفات فينيل).

متعدد انزيم الفحص باستخدام عالية الإنتاجية نظام فحص انزيم الوراثية

نصف بروتوكولا أساسيا لقياس نشاط ATPase في المختبر. يمكن تحسين هذا البروتوكول بناء على مستوى النشاط والمتطلبات الخاصة ب ATPase منقى معين.

قياس<em&gt; في المختبر</em&gt; أتباز آخر لالأنزيمية توصيف

هنا، نحن تصف إعداد واستخدام مسبار على أساس النشاط (ARN14686، undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية) التي تسمح للكشف والقياس الكمي ل الشكل النشط من الانزيم proinflammatory N أميداز حمض -acylethanolamine (ناا)، سواء في المختبر والمجراة سابقا.

إعداد و<em&gt; في فيفو</em&gt; استخدام من التحقيق على أساس آخر ل<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine حمض أميداز

تتطور الكينازات البروتينية بشكل كبير الإنزيمات والسقالات التي هي حاسمة لانتشار إشارة بين الخلايا وداخل الخلايا. نقدم بروتوكول لقياس نشاط كيناز من خلال استخدام أدينوسين ثلاثي الفوسفات راديولبلد ([γ- 32 P] أتب)، وهي طريقة موثوق بها للمساعدة في توضيح تنظيم الإشارات الخلوية.

فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

التوسع في الشفرة الجينية بمثابة أداة قوية لدراسة طائفة واسعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك أسيتيليشن البروتين. هنا نظهر بروتوكول سهلة لاستغلال هذه التقنية لتوليد البلوتينيوم أسيتيلاتيد البروتينات في مواقع معينة في خلايا الإشريكيّة القولونية .

بروتوكول سهلة لتوليد بروتينات سيتيسبيسيفيكالي أسيتيلاتيد في الإشريكيّة القولونية

والهدف من هذا البروتوكول هو التسمية، وإثراء، وتحديد ركائز للبروتين كيناز CK2 من عينة بيولوجية معقدة مثل خلية ليستي أو هوموجيناتي الأنسجة. هذا الأسلوب روافع الجوانب الفريدة للبيولوجيا CK2 لهذا الغرض.

تحديد ركائز كيناز CK2 الرواية باستخدام نهج بيوكيميائية تنوعاً

وصفنا بروتين كيناز جديد باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية: تحليل وصمة عار الغربية مع الأجسام المضادة مخصصة محددة على خطوط الخلايا المختلفة والأنسجة، والتفاعلات من قبل التجارب coimmunoprecipitation، نشاط كيناز الكشف عن طريق الغربية وصمة عار باستخدام الأجسام المضادة الفوسفاتية محددة وعن طريق γ [32P ] ATP وسم.

توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد

يظهر هنا مقايسة مضان حساسة لمراقبة نشاط البروتين الشحمي N-acyltransferase باستخدام ببتيد ثنائي أسيل جليسريل وألكاين فوسفوليبيدات كركائز مع كيمياء النقر.

الفحص الفلوري القائم على كيمياء النقر ل Apolipoprotein N-acyltransferase من توصيف الإنزيم إلى الفحص عالي الإنتاجية

في هذه الورقة ، يتم تقديم طرق السمية البيئية الموحدة لتقييم المؤشرات الحيوية في أنواع الأنوران الاستوائية الجديدة. على وجه التحديد ، توضح هذه الورقة بالتفصيل العديد من المنهجيات على نطاقات مختلفة من تقييم السموم البيئية ، مثل المستويات الجينية والخلوية النسيجية والكيميائية الحيوية والمورفولوجية والفردية.

منهجيات السموم البيئية لتقييم المؤشرات الحيوية على نطاقات مختلفة في الأنوران الاستوائية الجديدة

تعد المقايسات الكيميائية السريعة والدقيقة للكشف عن مثبطات محددة أداة مهمة في ترسانة تطوير الأدوية. هنا ، نقدم مقايسة كيميائية قابلة للتطوير فوق الأسيتيل لقياس تثبيط نشاط أستلة HAT1.

مقايسة كيميائية أسيتيل كليك لقياس هيستون أسيتيل ترانسفيراز 1 أسيتيل

اكتشف طريقة قياس مباشر لنشاط كيناز الخلات في اتجاه تشكيل الخلات باستهلاك فوسفات الأسيتيل. تُحدد المعادلات الحركية للإنزيم وتُطبق على إنزيمات أخرى تستخدم فوسفات الأسيتيل.

الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات

استكشف المزيد من الفيديوهات