الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات

تهدف هذه التجربة إلى القياس المباشر لنشاط تكوين الأسيتات لإنزيم كيناز الأسيتات. ابدأ التفاعل بإضافة الإنزيم إلى خليط تفاعل يحتوي على فوسفات الأسيتيل وركائز DP. ثم أضف هيدروكلوريد الهيدروكسيلامين لتحويل فوسفات الأسيتيل المتبقي إلى هيدروكسيلامات الأسيتيل.

أضف محلول التحميض لتحويل أسيتيل الهيدروكسيلات إلى معقد هيدروكسيلات الحديديك الملون الذي يمكن قياسه. تتيح النتائج القائمة على القياس الطيفي الضوئي لكمية ركيزة أسيتيل الفوسفات المستهلكة في التفاعل تحديد معاملات حركية الإنزيم. وتكمن ميزة هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في اعتمادها على القياس المباشر لاستهلاك أسيتيل الفوسفات بدلاً من ربط إنتاج TP باختزال ADP. ونظراً لأن هذا المقايسة لا تعتمد على إنتاج TP، فيمكن استخدامها لمجموعة جديدة من كاينيزات الأسيتات التي تنتج فوسفات غير عضوي بدلاً من TP. ولإعداد منحنى قياسي يتكون من ست إلى ثماني نقاط، خفف المحلول المخزون من أسيتيل الفوسفات في 100 millimolar triss حتى يصل الحجم النهائي للعينة إلى 300 µL، مع إدراج عينة ضابطة بدون أسيتيل الفوسفات، ثم قم بموازنة جميع العينات في كتلة تسخين عند 37 °C لمدة دقيقة واحدة.

الآن، أضف 50 µL من هيدروكسيلامين هيدروكلوريد بتركيز 2 M، واخلط عن طريق الرج ثلاث مرات، ثم حضن العينات في كتلة تسخين عند 60 °C لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول الإظهار، واخلط عن طريق الرج ثلاث مرات، واترك اللون يتطور لمدة دقيقة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء عملية الطرد المركزي للعينات باستخدام كوفيتات بلاستيكية مخصصة لجهاز spectrophotometer.

قم بقياس العينات عند 540 نانومتر. انتقل بعد ذلك إلى إنشاء منحنى قياسي للامتصاصية عند 540 نانومتر مقابل ميكرومول من أسيتيل الفوسفات باستخدام برنامج مناسب لتحليل البيانات والرسم البياني. احسب قيمة r squared.

قم بتوزيع حصص مقدارها 300 µL من خليط التفاعل في أنابيب طرد مركزي دقيقة. تذكر تضمين تفاعل ضابط بدون إنزيم، ثم قم بموازنة الأنابيب لمدة دقيقة واحدة عند 37 °C. في حال إجراء عدة تفاعلات، أضف الإنزيم إلى الأنابيب في فواصل زمنية محددة وأعد كل أنبوب فوراً إلى الكتلة الحرارية عند 37 °C.

بعد مرور خمس دقائق، أضف 50 µL من هيدروكسيلامين هيدروكلوريد بتركيز 2 M، ثم اخلط المزيج واتركه في الحاضنة لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 60 °C. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول الإظهار، واخلط المزيج ثم اتركه في درجة حرارة الغرفة حتى يظهر اللون. أخيراً، قم بطرد العينات مركزياً بسرعة 18,000 ×g لمدة دقيقة واحدة.

انتقل لقياس الامتصاصية عند 540 نانومتر. حدد كمية acetyl phosphate الموجودة من خلال المقارنة بمنحنى القياس الخاص بـ acetyl phosphate. يمكن رسم البيانات ومطابقتها مع معادلة McKayla Cementin لتحديد المعلمات الحركية.

يحدد هذا المقايسة استهلاك ركيزة أسيتيل الفوسفات لقياس نشاط كيناز الأسيتات في اتجاه تكوين الأسيتات. يتم تحويل أسيتيل الفوسفات المتبقي بعد وقت محدد خلال التفاعل الإنزيمي إلى أسيتيل أوكسيبات، ثم لاحقاً إلى معقد هيدروكسي أسيتات الحديديك، والذي يتميز بلون محمر يمكن قياسه عند 540 نانومتر. يمتلك منحنى المعايرة القياسي النموذجي الذي يرسم الامتصاصية عند 540 نانومتر مقابل ميكرومول أسيتيل الفوسفات ميلاً قدره 1.2332 وحدة امتصاصية لكل ميكرومول أسيتيل الفوسفات.

تشير قيمة r squared الناتجة والبالغة 0.99 إلى أن البيانات تتوافق جيداً مع المعادلة الخطية كما هو موضح هنا. يمكن استخدام هذا المقايسة لتحديد قيمة KM لأستيل الفوسفات لمختلف تحضيرات الإنزيمات. عند تركيز 5 millimolar من DP مع تركيزات متفاوتة من أستيل الفوسفات، يتبع إنزيم acetate kinase المؤتلف والمنقى من methanol Sarina thermophilic حركية Michaelis-Menten القياسية لكل مادة تفاعل، مما أدى إلى قيمة KM ظاهرة بلغت 0.27 ± 0.01 millimolar من أستيل الفوسفات.

على عكس المقايسة المقترنة القياسية، يمكن لهذه المقايسة المباشرة قياس نشاط كينازات الأسيتات التي تستخدم ركائز أخرى غير الثلاثي فوسفات (TP). على سبيل المثال، عند استخدام أسيتيل فوسفات بواسطة كيناز أسيتات *E. histolytica* المنتج للبيروفوسفات، تم استبدال ثنائي الفوسفات (DP) بفوسفات الصوديوم في مزيج التفاعل. ويشير المنحنى الناتج إلى قيمة KM ظاهرة تبلغ 0.50 ± 0.006 millimolar لأسيتيل فوسفات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك تصور جيد حول كيفية قياس نشاط كيناز الأسيتات بشكل مباشر من خلال تحديد كمية أسيتيل فوسفات المستهلكة.

يعد الالتزام بالاتساق في كل خطوة عاملاً رئيسياً في الحصول على نتائج قابلة للتكرار، لا سيما عند إضافة الإنزيم وفي خطوة الخلط.