الكشف عن مباشرة النشاط خلات تشكيل لأنزيم كيناز خلات

تهدف هذه التجربة إلى قياس مباشر لنشاط تكوين الأسيتات في كيناز الأسيتات. ابدأ التفاعل بإضافة إنزيم إلى خليط تفاعل يحتوي على فوسفات الأسيتيل وركائز DP. ثم أضف هيدروكسي لامين هيدروكلوريد لتحويل فوسفات الأسيتيل المتبقي إلى أسيتيل هيدروكسيلات.

أضف محلول تطوير لتحويل أسيتيل هيدروكسيلات إلى مركب هيدروكسيل الحديديك الملون الذي يمكن قياسه. يسمح الطيف الضوئي بناء على كمية ركيزة فوسفات الأسيتيل المستهلكة في نتائج التفاعل بتحديد المعلمات الحركية للإنزيم. ميزة هذه التقنية على الطرق الحالية ، فهي تعتمد على القياس المباشر لاستهلاك فوسفات الأسيتيل بدلا من اقتران إنتاج TP بتقليل A DP. نظرا لأن هذا الاختبار لا يعتمد على إنتاج TP ، فيمكن استخدامه لمجموعة جديدة من كينازات الأسيتات ، التي تنتج فوسفات الطاقة بدلا من TP للحصول على منحنى قياسي من ست إلى ثماني نقاط ، قم بتخفيف محلول مخزون فوسفات الأسيتيل في 100 مللي مولار إلى حجم عينة نهائي يبلغ 300 ميكرولتر ، كما يتضمن عينة تحكم بدون فوسفات الأسيتيل موازنة جميع العينات في كتلة حرارية 37 درجة مئوية ل دقيقة.

الآن ، أضف 50 ميكرولترا من اثنين من هيدروكسي لامين هيدروكلوريد مولار ، واخلطها عن طريق الرج ثلاث مرات واحتضانها في كتلة حرارية 60 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم أضف 100 ميكرولتر من مزيج محلول التطوير عن طريق الرج ثلاث مرات واترك اللون يتطور لمدة دقيقة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي للعينات باستخدام كوفيت بلاستيكي لمقياس الطيف الضوئي.

قم بقياس العينات عند 540 نانومتر. تابع إنشاء منحنى قياسي للامتصاص عند 540 نانومتر مقابل ميكرومول من فوسفات الأسيتيل باستخدام برامج تحليل البيانات والرسوم البيانية المناسبة. احسب قيمة r تربيع.

توزيع 300 ميكرولتر من مزيج التفاعل على أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تذكر تضمين تفاعل تحكم بدون أنابيب متوازنة للإنزيم لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية. إذا تم إجراء عدة تفاعلات ، أضف الإنزيم إلى الأنابيب على فترات زمنية محددة وأعد كل أنبوب على الفور إلى كتلة الحرارة 37 درجة مئوية.

بعد خمس دقائق ، أضف 50 ميكرولترا من اثنين من هيدروكسي لامين هيدروكلوريد مولار ، واخلطها واحتضانها لمدة خمس دقائق عند 60 درجة مئوية. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول التطوير ، واخلطه وضعه في درجة حرارة الغرفة لتطوير اللون. ثم عينات أجهزة الطرد المركزي عند 18 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة.

تابع قياس الامتصاص عند 540 نانومتر. تحديد كمية فوسفات الأسيتيل الموجودة بالمقارنة مع منحنى أسيتيل فوسفات القياسي. يمكن رسم البيانات وملاءمتها لمعادلة McKayla Cementin لتحديد المعلمات الحركية.

يحدد هذا الاختبار استهلاك ركيزة فوسفات الأسيتيل لقياس نشاط أسيتات كيناز في اتجاه تكوين الأسيتات. يتم تحويل فوسفات الأسيتيل المتبقي بعد وقت معين أثناء التفاعل الأنزيمي إلى أسيتيل أوكسيبات ثم إلى مركب هيدروكسي الحديديك ، الذي له لون ضارب إلى الحمرة يمكن قياسه عند 540 نانومتر. هذا الامتصاص القياسي النموذجي لرسم المنحنى عند 540 نانومتر مقابل ميكرومول أسيتيل فوسفات له ميل يبلغ 1.2332 وحدة امتصاص لكل ميكرومول فوسفات أسيتيل.

تشير قيمة r التربيعية الناتجة البالغة 0.99 إلى أن البيانات تتناسب بشكل جيد مع المعادلة الخطية كما هو موضح هنا. يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد KM لفوسفات الأسيتيل لمستحضرات الإنزيم المختلفة. عند خمسة مللي مولار ، يتبع DP بتركيزات متفاوتة من أسيتات كيناز المؤتلف المنقى من الميثانول Sarina المحب للحرارة الحركية القياسية مثل الأسمنت McKayla لكل ركيزة مما ينتج عنه KM واضح قدره 0.27 زائد أو ناقص 0.01 مللي مولار من فوسفات الأسيتيل.

على عكس المقايسة المقترنة القياسية ، يمكن لهذا الاختبار المباشر قياس نشاط كينازات الأسيتات التي تستخدم ركائز أخرى غير TP. على سبيل المثال ، في استخدام فوسفات الأسيتيل بواسطة بيروفوسفات المنتج inba histolytica acetate kinase ، تم استبدال فوسفات الصوديوم ب DP في مزيج التفاعل. يشير المنحنى الناتج إلى قيمة KM ظاهرة تبلغ 0.50 زائد أو ناقص 0.006 مللي مولار من فوسفات الأسيتيل. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية قياس نشاط أسيتات كيناز مباشرة عن طريق تحديد كمية فوسفات الأسيتيل المستهلكة.

يتمثل أحد العوامل الرئيسية في الحصول على نتائج قابلة للتكرار في أن تكون متسقا في كل خطوة ، خاصة في إضافة الإنزيم وفي خطوة الخلط.