المنسدلة من كالمودولين ملزم البروتينات

الهدف العام من هذا الإجراء هو اختبار البروتينات التي ترتبط بـ Cal Modlin بطريقة تعتمد على الكالسيوم. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع البروتينات ذات الصلة، ثم تحضير خرزات calmodulin sero لربط البروتين.

بعد ذلك، يتم تحضين البروتينات مع خرزات calmodulin. وفي النهاية، يتم استخلاص البروتينات التي ترتبط بها بطريقة تعتمد على الكالسيوم. وفي الختام، يمكن الحصول على نتائج توضح البروتينات التي ترتبط بـ calmodulin سواء في وجود الكالسيوم أو غيابه من خلال تحليل western blot.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية الأخرى، مثل الكروماتوغرافيا العمودية والترسيب المناعي، في أنها تتطلب كمية أقل من البروتين ووقتاً أقل. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال إشارات cow modlin، مثل تحديد البروتينات التي ترتبط بـ cow modlin بطريقة تعتمد على الكالسيوم، وكيف يمكن للتعديلات ما بعد الترجمية أن تؤثر على ارتباطها بـ cow modlin. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لأن خطوات التعامل مع الخرزات أساسية، كما أن وصف عمليات إعادة تعليق الخرزات واحتجازها يصعب متابعته دون رؤيتها.

لتجهيز الأنسجة من أجل حقن شرائح حصينية نمطية الأعضاء متجانسة بفيروس يحتوي على بلازميد يعبر عن البروتين المؤتلف المطلوب. في هذا المثال، البروتين المؤتلف هو Neuro Grandin الموسوم بـ GFP. اترك الأنسجة لتعبر عن البروتين طوال الليل، أي لمدة تتراوح تقريبًا بين 12 إلى 18 ساعة بعد الحقن الفيروسي، ثم أضف 1 mL من محلول التشريح المنظم إلى طبق بتري.

انقل النسيج المستزرع مع الغشاء الإدراجي إلى طبق بتري، وأضف 2 mL من محلول التشريح المنظم إلى الإدراج لغمر النسيج باستخدام مشرط. اجمع من 5 إلى 10 شرائح نسيجية من الحصين ذات نمط عضوي عن طريق كشط النسيج برفق لتحريره من غشاء الإدراج باستخدام ماصة باستور مقلوبة. انقل النسيج العالق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL.

بعد ذلك، يتم طرد العينات مركزياً عند 1500 RCF لمدة دقيقة واحدة. ولفصل النسيج عن محلول التقطيع المنظم، قم بإزالة السائل العلوي بعناية عن طريق الشفط، مع الحرص على عدم تحريك الراسب.

لكل شريحة مستخدمة، أضف النسيج إلى 30 إلى 60 µL من منظم التجانس باستخدام ماصة سعة 1 mL ذات طرف مقصوص، ثم قم بتجنيسه جيداً باستخدام مدقة قبل إعادة المتجانس إلى أنبوبته الأصلية. ولإزالة الحطام الخلوي، قم بطرد المتجانس المتبقي مركزياً عند 1100 RCF لمدة 10 دقائق، واجمع الراشح بعناية عن طريق الشفط مع تجنب التلوث من الراسب. ثم قم بتجزئة 10% من الراشح كعينة من المدخلات.

يُحفظ السائل الطافي المتبقي على الثلج أثناء تحضير خرزات cal sero لاستخدامها. لاحقاً، ومن أجل كل عملية سحب، يتم سحب 400 µL من خرزات cal Modlin Sero المعلقة بواسطة الماصة ووضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 mL ذو قاع مسطح نسبياً لزيادة مساحة السطح وتفاعل المحاليل مع الخرزات أثناء فترات التحضين، ثم يُدور الأنبوب الدقيق على جانبه لترطيب الخرزات، وبعد ذلك يتم طرد الخرزات مركزياً عند 21,000 ×g لمدة 30 ثانية.

ثم قم بإزالة الطافي بعناية عن طريق الشفط. تأكد من عدم تحريك الخرزات لغسل الخرزات بـ 100 µL من محلول التجانُس المنظم المناسب الذي يحتوي إما على 2 mM من كلوريد الكالسيوم للخرزات المستخدمة لسحب البروتينات المرتبطة بـ calcium calmodulin، أو 2 mM من EDTA، وهو مخلب كالسيوم معروف، للخرزات المستخدمة لسحب البروتينات المرتبطة بـ apo calmodulin.

انقر بلطف على الأنبوب لإعادة التعليق. قم بتعليق الخرزات ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 1500 RCF لمدة دقيقة واحدة. أزل السائل الطافي بعناية عن طريق الشفط، مع التأكد من عدم تحريك الخرزات لربط البروتينات بخرزات الكالمودولين (calmodulin spheros) لعملية السحب (pull down).

ابدأ بتقسيم الـ SNAT إلى حجمين متساويين. وبناءً على الحالة الخاصة بكل جزء، أضف الكمية المناسبة من كلوريد الكالسيوم أو EDTA إلى السائل الطافي للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2 mM. ثم أضف السائل الطافي إلى الخرز المغسول في محلول التجانس المناسب.

انقر بلطف على الأنبوب للمزج. قم بحضن العينات عند درجة حرارة 4 °C لمدة ثلاث ساعات على جهاز هزاز. نقوم بتعليق الخرزات كل 30 دقيقة تقريبًا لزيادة كفاءة الارتباط.

بعد ذلك، يتم طرد العينات مركزياً عند 1500 RC F لمدة ثلاث دقائق. يتم سحب 50 µL من السائل الطافي كعينة من البروتين غير المرتبط، ثم يتم سحب السائل الطافي المتبقي بعناية عن طريق الشفط والتخلص منه. تُغسل الخرزات ثلاث مرات كما سبق باستخدام 100 µL من محلول التجانُس المناسب.

تتمثل الخطوة الأكثر صعوبة في هذا الإجراء في استخلاص البروتينات المستهدفة بطريقة فعالة. وأفضل طريقة لضمان النجاح هي استخدام النوع المناسب من الأنابيب لتقليل فقدان الخرزات، وإعادة تعليق الخرزات بشكل مناسب في محلول الاستخلاص بعد تدفئته. كما يمكن أن يساعد تدفئة محلول الاستخلاص مسبقاً بشكل كبير في استخلاص البروتين، وذلك بإضافة 50 µL من محلول الاستخلاص إلى الخرزات.

يتم تعريض العينات التي جرى تجانسها وربطها في محلول منظم يحتوي على الكالسيوم لمحلول منظم يحتوي على EDTA، بينما يتم تعريض العينات التي كانت في محلول منظم يحتوي على EDTA للكالسيوم. تُحضن الخرزات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على جهاز هزاز. وتُخلط الخرزات عن طريق النقر بلطف على الأنبوب كل خمس دقائق تقريبًا.

قم بطرد الخرزات مركزياً عند 1500 RCF لمدة ثلاث دقائق، ثم قم بإزالة 50 microliters من SNAT لعينة البروتين المرتبط بعناية عن طريق الشفط. تأكد من عدم تحريك الخرزات. قم بإجراء SDS page وwestern blotting لتحديد البروتين المستهدف كعنصر تحكم إيجابي في الحالة المقابلة.

من المعروف أن بروتين Prop Pro يرتبط بـ Cal Modlin. يوضح هذا الشكل مثالاً لمقايسة سحب Cal Modlin لاختبار ارتباط GFP TAG Neuro Grandin بـ Cal MODLIN مقارنة بـ neuro Grandin الداخلي. يُظهر المدخل المتجانس أن GFP neuro Grandin قد تم التعبير عنه بالإضافة إلى neuro grandin الداخلي وcalcium calmodulin dependent kinase two كما هو متوقع بناءً على الارتباط المعروف لـ neuro Grandin الداخلي.

تم استخلاص بروتين Neuro Grandin المسمى بـ GFP في غياب الكالسيوم، ولم يرتبط في وجود الكالسيوم. وفي المقابل، تم استخلاص بروتين التحكم calcium calmodulin dependent kinase two فقط في وجود الكالسيوم، وكان غير مرتبط في غيابه. يوضح هذا أن حبيبات الكالمودولين كانت تعمل بشكل صحيح وأن وحدات EEU كانت فعالة.

والأهم من ذلك، يوضح هذا أن GFP neuro grinin يرتبط بـ Apoch Cal Modlin بطريقة مشابهة للشكل الداخلي، مما يشير إلى أن علامة GFP لم تغير وظيفة البروتين المؤتلف. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنهاء العمليات، باستثناء SDS page وتحليل Western blood، في غضون ست ساعات عند تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا البروتوكول، من المهم تذكر تمييز جميع العينات والأنابيب وفقاً للحالة المناسبة لأن أي تغيير في تركيز الكالسيوم يمكن أن يؤثر سلباً على التجربة بأكملها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد قدرة بروتينات معينة على الارتباط بـ CAL module بطريقة تعتمد على الكالسيوم بكفاءة.

من خلال جمع البروتينات المستهدفة، وتحضينها مع مُعدِّلات مشتركة مُعدة بشكل مناسب من SRO speeds، ثم استخلاص البروتينات المرتبطة واختبارها باستخدام تحليل Western blot.