المنسدلة من كالمودولين ملزم البروتينات

الهدف العام من هذا الإجراء هو اختبار البروتينات التي ترتبط ب Cal Modlin بطريقة تعتمد على الكالسيوم. يتم تحقيق ذلك عن طريق جمع البروتينات ذات الأهمية أولا. يتم تحضير سرعات مصل الكالمودولين التالية لربط البروتين.

ثم يتم تحضين البروتينات بسرعات مصل كالمودولين. أخيرا ، يتم التلميح إلى البروتينات التي ترتبط بطريقة تعتمد على الكالسيوم. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر البروتينات التي ترتبط بالكالمودولين إما في وجود أو عدم وجود الكالسيوم من خلال تحليل الدم الغربي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى الموجودة ، مثل الكروماتوغرافيا الهادئة والترسيب المناعي ، هي أنها تتطلب بروتينا أقل ووقتا أقل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إشارات مودلين البقرة ، مثل البروتينات التي ترتبط بمودلين البقرة بطريقة تعتمد على الكالسيوم ، وكيف يمكن أن تؤثر تعديلات ما بعد الترجمة على ارتباطها بمودلين البقرة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن خطوات التعامل مع الخرزة ضرورية ويصعب متابعة وصف الدقة والاحتفاظ بها دون رؤيتها.

لتحضير الأنسجة لحقن شرائح الحصين العضوية المتجانسة بفيروس يحتوي على بلازميد يعبر عن البروتين المؤتلف المعني. في هذا المثال ، يكون البروتين المؤتلف هو GFP الموسومة Neuro Grandin. اسمح للأنسجة بالتعبير عن البروتين طوال الليل بعد حوالي 12 إلى 18 ساعة من الحقن الفيروسي ، أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت للتشريح إلى طبق بتري.

انقل الأنسجة المستنبتة مع إدخالها إلى طبق بتري وأضف ملليلترين من المخزن المؤقت للتشريح إلى الملحق لغمر الأنسجة باستخدام مشرط. اجمع خمس إلى 10 شرائح من أنسجة الحصين العضوية عن طريق كشط الأنسجة برفق الخالية من غشاء الإدخال باستخدام ماصة المراعي المقلوبة. انقل الأنسجة العالقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 1500 RCF لمدة دقيقة واحدة. لفصل الأنسجة عن المخزن المؤقت للتشريح ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الشفط. تأكد من عدم إزعاج الحبيبات.

لكل شريحة مستخدمة ، أضف الأنسجة إلى 30 إلى 60 ميكرولترا من مخزن التجانس باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد بطرف مقطوع ، ثم قم بتجانسها جيدا باستخدام مدقة قبل إعادة التجانس إلى أنبوبه الأصلي. من أجل إزالة الحطام الخلوي ، قم بالطرد المركزي المتجانس المتبقي عند 1100 RCF لمدة 10 دقائق وجمع snat بعناية عن طريق الشفط مع تجنب التلوث من الحبيبات. Aliquot 10٪ من المادة الطافية كعينة من المدخلات.

قم بتخزين المادة الطافية المتبقية على الثلج أثناء تحضير حبات السيرو للاستخدام. في وقت لاحق ، لكل ماصة منسدلة 400 ميكرولتر من سرعات Modlin Sero المعلقة في أنبوب طرد مركزي صغير سعة ملليلترين مع قاع مسطح نسبيا لزيادة مساحة السطح وتفاعل المحاليل مع الخرزات أثناء الحضانات ، قم بتدوير أنبوب الطرد المركزي الصغير على جانبه لترطيب الخرزات ، ثم الطرد المركزي للحبات عند 21 ، 000. RCF لمدة 30 ثانية.

وإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الشفط. تأكد من عدم إزعاج الخرزات لغسل الخرزات عند 100 ميكرولتر من مخزن التجانس المعني الذي يحتوي إما على اثنين من كلوريد الكالسيوم المليمولار إلى الخرز المستخدم لسحب بروتينات ربط الكالسيوم كال. أو اثنين من مخلب الكالسيوم المعروف E-D-T-A-A للخرز المستخدم لسحب بروتينات ربط apo cal modlin.

اضغط برفق على الأنبوب إلى Resus. قم بتعليق الخرزات وأجهزة الطرد المركزي عند 1500 RCF لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الشفط ، مع التأكد من عدم إزعاج الخرزات لربط البروتينات بأفيرو الكالمودولين لسحبها لأسفل.

ابدأ بتقسيم SNAT إلى مجلدين متساويين. اعتمادا على الحالة لكل حصة ، أضف الكمية المناسبة من كلوريد الكالسيوم أو EDTA إلى السوبر إلى التركيز النهائي البالغ ملليمول. أضف المادة الطافية إلى الخرزات المغسولة في مخزن التجانس المناسب.

اضغط برفق على الأنبوب للخلط. احتضان العينات عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات على شاكر. نقوم بتعليق الخرزات كل 30 دقيقة أو نحو ذلك لزيادة كفاءة الربط.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 1500 RC F لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة 50 ميكرولترا من المادة الطافية كعينة من البروتين غير المرتبط وقم بإزالة القطعة المتبقية بعناية عن طريق الشفط والتخلص منها. اغسل الخرزات ثلاث مرات كما كان من قبل باستخدام 100 ميكرولتر من مخزن التجانس المناسب.

أصعب خطوة في هذا الإجراء هي تحليل البروتينات المستهدفة بطريقة فعالة. أفضل طريقة لضمان النجاح هي استخدام النوع المناسب من الأنبوب لتقليل فقد الخرزة وإعادة تعليق الخرزات بشكل مناسب في احترار عازلة الشطف. يمكن أن يساعد المخزن المؤقت للشطف مسبقا أيضا بشكل كبير في التخلص من البروتين عند 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت elucian للخرز.

الإشارة إلى العينات التي تم تجانسها وربطها في مخزن مؤقت يحتوي على الكالسيوم في المخزن المؤقت المحتوي على EDTA والعينات التي تحتوي على مخزن مؤقت يحتوي على EDTA يتم الإشارة إليها بالكالسيوم. احتضان الخرز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على شاكر. امزج الخرزات عن طريق النقر برفق على الأنبوب كل خمس دقائق تقريبا.

قم بالطرد المركزي للحبات عند 1500 RCF لمدة ثلاث دقائق وقم بإزالة 50 ميكرولترا من SNAT بعناية لعينة البروتين المرتبطة عن طريق الشفط. تأكد من عدم إزعاج الخرز. قم بإجراء صفحة SDS والنشاف الغربي لتحديد البروتين محل الاهتمام كعنصر تحكم إيجابي في الحالة المعاكسة.

بروتين Prop Pro المعروف بربط Cal Modlin. يوضح هذا الشكل مثالا على اختبار Cal Modlin المنسدل لأسفل الذي يختبر ارتباط Cal MODLIN ل GFP TAG Neuro Grandin مقارنة ب Grandin العصبي الذاتي. تظهر المدخلات المتجانسة أن GFP العصبي Grandin تم التعبير عنه بالإضافة إلى غراندين العصبي الداخلي وكيناز كالمودولين المعتمد على الكالسيوم كما هو متوقع بناء على الارتباط المعروف للعصبية الذاتية Grandin.

التلميح إلى GFP الموسومة Neuro Grandin في غياب الكالسيوم ولم يرتبط في وجود الكالسيوم. في المقابل ، تم التلميح إلى كيناز الكالسيوم المعتمد على كالمودولين الثاني فقط في وجود الكالسيوم وكان غير مرتبط في غيابه. هذا يدل على أن حبات الكالمودولين كانت تعمل بشكل صحيح وأن EEU كانت فعالة.

الأهم من ذلك ، أن هذا يدل على أن ابتسامة GFP العصبية ترتبط ب Apoch Cal Modlin بطريقة مشابهة للشكل الداخلي ، مما يشير إلى أن علامة GFP لم تغير وظيفة البروتين المؤتلف. بمجرد إتقان هذه التقنية ، لا يمكن الانتهاء من تحليل الدم الغربي في غضون ست ساعات عند القيام به بشكل صحيح أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تسمية جميع العينات والأنابيب للحالة المناسبة لأن أي تغيير في تركيز الكالسيوم يمكن أن يضر بالتجربة بأكملها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد قدرة بروتينات معينة بكفاءة على ربط وحدة CAL بطريقة تعتمد على الكالسيوم.

من خلال جمع البروتينات ذات الأهمية ، واحتضانها بسرعات SRO المعدلة المعدة بشكل مناسب ، والتهرب من البروتينات المرتبطة واختبارها باستخدام تحليل الدم الغربي.