وفي اشارة الى نقص الأوكسجين داخل تعقب المجاميع خلية مغلف

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة الاستجابة الخلوية لنقص الأكسجة في تجمعات خلوية مغلفة بـ PEG. في الخطوة الأولى، تُعدى الخلايا المشتتة بالفيروس الواسم ثم تُزرع في هزاز للسماح بتكوين التجمعات. بعد ذلك، يتم تفعيل الـ peg الخطي وتنقية الـ PEG DM rimer.

بعد ذلك، يتم تغليف تجمعات الخلايا في هيدروجيل PEG DM. وأخيرًا، تُزرع الهيدروجيلات في ظروف أكسجين متنوعة مع مراقبتها فلوريسنتياً لرصد إشارة علامة نقص الأكسجة. وفي النهاية، يمكن تصور موقع ومدى نشاط العامل المحفز بنقص الأكسجة داخل تجمعات الخلايا الحية المغلفة من خلال المجهر الفلوريسنتي البسيط.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجالات تغليف الخلايا وإيصال العلاجات القائمة على الخلايا، مثل: أين يحدث نقص الأكسجة ضمن المزارع ثلاثية الأبعاد، وكيف يؤثر ذلك على بقاء الخلايا ووظيفتها؟ وتمتد تداعيات هذه التقنية لتشمل مناهج الطب التجديدي وعلاج نقص الهرمونات مثل مرض السكري، وذلك بسبب التأثير الكبير لنقص الأكسجة في الأنسجة المتجمعة والمغلفة. وقد تبين أن نشاط العامل المحفز لنقص الأكسجة 1 يرتبط بانخفاض كبير في إفراز الإنسولين من خلايا بيتا، مما دفع إلى محاولات تفكيك الجزر البنكرياسية الأولية وإعادة تشكيلها في هيئة جزر كاذبة.

تجمعات ذات قطر مختزل. يمكن لعلامتنا أن تشير إلى نشاط العامل المحفز بنقص الأكسجة مع وجود تجمعات على المستوى الخلوي ضمن أي مادة تغليف مفككة. تم اختيار PEG كمادة للكبسولة نظراً لخصائص النقل المواتية، والتوافق الخلوي، والسهولة التي يمكن بها تعديله وظيفياً.

بعد وزن جرامين من PEG في قارورة زجاجية سعة 40 ملليلتر مع إضافة 308 ميكرولتر تقريباً من meth, acrylic, anhydride، أغلق القارورة بشكل غير محكم باستخدام غطاء بلاستيكي صلب. ضع القارورة في ميكروويف منزلي قياسي على درجة حرارة عالية لمدة دقيقتين. بعد ذلك، وباستخدام قفازات مقاومة للحرارة، قم برج القارورة جيداً بواسطة جهاز vortex، ثم ضع المحلول في الميكروويف على درجة حرارة عالية لمدة خمس دقائق إضافية.

اترك القارورة تبرد لفترة وجيزة حتى يمكن التعامل معها، ثم افتح غطاءها مع تحريك القارورة بشكل دائري. أضف ميثيلين كلوريد ببطء، مع استخدام جهاز الـ vortex للعينة حسب الحاجة حتى يظهر المحلول رائقاً ومتجانساً. بعد ذلك، أضف المحلول قطرة تلو الأخرى إلى 200 milliliters من إيثر الداتيل البارد والمحرك لترسيب PEG dm.

بعد ذلك، قم بجمع PEG DM عن طريق الترشيح الفراغي واتركه ليجف. وبمجرد جفاف PEG DM، قم بإذابته في حوالي 100 إلى 150 milliliters من الماء منزوع الأيونات. ثم قم بعملية الديلزة (الديال) للمحلول مقابل الماء منزوع الأيونات لمدة خمسة أيام باستخدام أنابيب ديلزة ذات حد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 1000 Daltons بعد الديلزة.

قم بتوزيع المحلول في حاويات مناسبة وتجميدها عند -80 °C طوال الليل. بعد ذلك، قم بتجفيف المحلول بالتجميد (lyophilize) لمدة أربعة أيام لإنتاج مسحوق PEG DM أبيض نقي لتحرير الخلايا من سطح قارورة المزرعة المعالجة. أولاً، قم بشفط الوسط، واغسل الخلايا بمحلول HBSS خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم عند 37 °C، ثم اشفط محلول HBSS.

أضف الآن 2 mL من محلول trypsin و EDTA بدرجة حرارة 37 °C، واترك الخلايا لتتحضن عند 37 °C لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، قم بهز جانب القارورة بقوة لتحرير الخلايا، ثم أضف 8 mL من الوسط الغذائي بدرجة حرارة 37 °C إلى القارورة، وقم بسحب وتعليق معلق الخلايا باستخدام الماصة بقوة صعوداً وهبوطاً، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات هوائية.

بعد نقل محلول الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 milliliter، قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer) لتحديد العدد الإجمالي للخلايا المراد إصابتها. أضف الحجم اللازم من معلق الخلايا لتحقيق كثافة 400, 000 خلية لكل بئر في آبار لوحة زراعة معلقة سداسية الآبار، ثم انقل 50 microliters من محلول HBSS لكل بئر من الخلايا المراد إصابتها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.8 milliliter. بعد ذلك، قم بنقل الكمية المناسبة من معلق الفيروس بعناية باستخدام الماصة إلى محلول HBSS المُجهز.

الآن، أضف الحجم المناسب من الفيروس المخفف إلى كل بئر لتحقيق تعدد العدوى (MOI) المطلوب، ثم أضف الوسط الغذائي إلى كل بئر لرفع الحجم الإجمالي إلى 1.7 milliliters. أخيرًا، ضع الطبق على هزاز مداري داخل الحاضنة، واضبط الهزاز على إعداد منخفض حوالي 100 RPM بحيث يغسل الوسط الغذائي البئر بلطف، واترك الخلايا تتجمع لمدة تتراوح من 24 إلى 36 ساعة. ابدأ بقطع الطرف المستدق لمحفنة بلاستيكية سعة one milliliter ووضعها بحيث تكون الفتحة متجهة للأعلى في حامل لإنشاء وعاء يتم فيه تكوين الهيدروجيل.

بعد ذلك، انقل 20 µL من محلول PEG DM النشط ضوئياً بواسطة الماصة إلى الطرف المفتوح من المحقنة فوق المكبس، مع التأكد من أن الحجم يغطي سطح المكبس بالكامل. قم بتعديل وضع المكبس بزيادات صغيرة لتحقيق سطح سائل مستوٍ. الآن، أعد الماصة إلى الحامل وضع الحامل تحت مصباح UV لمدة ثماني دقائق تقريبًا للسماح بالتشابك المتقاطع للهيدروجيل.

خلال هذا الوقت، انقل بواسطة الماصة حجماً يحتوي على العدد المطلوب من الخلايا والتجمعات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.8 milliliter. أغلق الأنبوب بإحكام، ثم قم بطرد الخلايا والتجمعات مركزياً لمدة خمس دقائق عند 130 gs. بعد ذلك، وباستخدام ماصة دقيقة، قم بإزالة الطافي بعناية دون تعكير راسب الخلايا الموجود في طرف الأنبوب.

عندما يقترب رأس الوسط من الراسب، استخدم طرف ماصة أدق بسعة 10 microliter لتوزيع تجمعات الخلايا بالتساوي في محلول السلائف الهلامي مع ضمان تغليفها بالكامل. هذا هو الجزء الأكثر دقة في هذا الإجراء. عند تنفيذ هذه الخطوة، احرص على إعادة تعليق الراسب ونقله بلطف.

الآن، قم بإعادة تعليق كتلة الخلايا بلطف في 20 µL من محلول PEG DM النشط ضوئياً. وباستخدام رأس ماصة واسع الفتحة، أضف معلق الخلايا إلى المحقنة فوق جزء الهيدروجيل المتشابك، ثم عرّض المحقنة لثماني دقائق إضافية من الأشعة فوق البنفسجية (UV) لإتمام بناء الهيدروجيل. عند الانتهاء، يجب أن تكون الخلايا مغلفة بالكامل داخل الهيدروجيل الأسطواني.

أخيرًا، أضف 1 mL من HBSS في بئر واحد من طبق يحتوي على 24 بئرًا، وأضف 1 mL من الوسط الغذائي في بئر آخر. ثم قم بدفع الهيدروجيل من المحقنة إلى HBSS لغسل الجل لفترة وجيزة. انقل الجل إلى الوسط الغذائي وازرع الطبق تحت الظروف المطلوبة.

في أي نقطة خلال عملية الزرع، يمكن تصوير الخلايا باستخدام المجهر الفلوري لتتبع بدء مسار التأشير بنقص الأكسجين، وذلك بوضع الطبق ذو الـ 24 بئراً على منصة المجهر، مع تمركز البئر الذي يحتوي على الهيدروجيل تحت العدسة الشيئية. وتكون الإشارة محددة بما يكفي لتمييز الخلايا المؤشرة بشكل فردي، ولكن قد تكون الدقة غير كافية لتحديد موضع الإشارة داخل الخلايا. وفي الخلايا المؤشرة، تظهر الإشارة عادةً بشكل موحد في جميع أنحاء السيتوبلازم.

يوضح هذا الشكل مثالاً نموذجياً لتجمعات خلايا minx المغلفة في هيدروجيل PEG داخل خلية الهلام. يجب أن تكون التجمعات محاطة بالكامل في المصفوفة وموزعة بشكل متجانس للسماح بنقل أفضل للمواد المغذية كما هو موضح هنا. لاحظ كيف أن الهلام المتشابك صلب في جميع أنحائه، متخذاً شكل الوعاء الذي أُجري فيه التفاعل.

يظهر في هذا الشكل إشارات الفلوريسنت التمثيلية لنقص الأكسجة في خلايا min six المتجمعة داخل هيدروجيل PEG DM، حيث تم تغليف الخلايا ثم وضعها في الحضانة تحت تركيز 20% oxygen لمدة 44 ساعة. ولا تظهر الخلايا المصورة على اليسار إشارات نقص الأكسجة، بينما تظهر الخلايا التي تم تغليفها ثم حضنها في تركيز 2% oxygen لمدة 44 ساعة، كما هو موضح على اليمين، إشارة واضحة وشاملة؛ ويمكن تتبع نقص الأكسجة في أنواع أخرى من الخلايا أيضاً.

يوضح هذا الشكل إشارات نقص الأكسجة التمثيلية في تجمعات الخلايا الجذعية الميزنكيمية المغلفة. وكما يتضح في الشكل الموجود في أقصى اليسار، فإن الإشارة الفلورية غير قابلة للكشف بعد 12 ساعة في 2%oxygen، ثم كما يظهر في الشكل الأوسط، تصبح أكثر وضوحاً بعد 24 ساعة و2%oxygen. وأخيراً، كما يظهر في جهة اليمين، يتم التعبير عنها بشكل عالٍ بعد 96 ساعة و2%oxygen باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل مقايسة ELISA، وتحليل البروتينات المفرزة، ومقايسات حيوية الخلايا، وذلك من أجل ربط إشارات نقص الأكسجة بالنمط الظاهري للخلايا. ومن خلال هذا التطوير، يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجالات هندسة الأنسجة وتوصيل العلاجات القائمة على الخلايا لاستكشاف وظيفة البقاء وتمايز الخلايا داخل السقالات ومواد التغليف.