النمذجة والتصوير 3 الأبعاد غزو الخلية الجماعية

يهدف هذا النظام التجريبي إلى توصيف مساهمة بروتينات محددة في عملية الغزو. ابدأ بإجراء ترنسدكشن ريتروفيروسي للخلايا باستخدام البروتين الفلوري المطلوب. قم أيضاً بإنشاء مصفوفة ثلاثية الأبعاد من بروتين matrigel في أدراج transwell، وجهز معلقاً خلوياً بالتخفيف المناسب.

باستخدام نظام Matrigel transwell، قم بقياس استجابة الهجرة عبر الغشاء تجاه الجاذب الكيميائي مع استخدام الأدوية أو العلاجات المختبرة، ثم انتقل إلى تصوير وتحليل غزو الخلايا بواسطة المجهر البؤري (confocal microscopy). وفي النهاية، يمكن للنتائج تحديد مقدار ونمط غزو الخلايا إلى مصفوفة بروتينية ثلاثية الأبعاد. وتكمن قوة هذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل مقايسة غزو Transwell التقليدية في قدرتها على تقديم بيانات كمية ونوعية حول غزو الخلايا لمصفوفة بروتينية ثلاثية الأبعاد.

ستقوم زميلتي، Diane Creighton، الآن باستعراض طريقة استزراع خلايا تغليف الفيروسات القهقرية في وسط DMEM المحتوي على 10%FBS لمدة 48 ساعة. يتم ترنسفكشن الخلايا بالحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين للفيروس القهقري وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. تُحضن الخلايا لمدة 24 ساعة، ثم تُشطف الآبار مرتين بالوسط، وبعد ذلك يُضاف 1.5 milliliters من 10%F-P-S-D-M-E-M لكل بئر، وتُحضن لمدة 48 ساعة لجمع الفيروس القهقري المغلّف.

انقل وسط استزراع الأنسجة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة اثنين مللي لتر، ثم قم بإجراء الطرد المركزي لترسيب أي خلايا وجمع السائل الطافي في أنبوب نظيف. يُحفظ مخزون الفيروس القهقري هذا في درجة حرارة 80- درجة مئوية. والآن لإجراء ترنسدكشن للخلايا بالفيروس القهقري، قم بإزالة الوسط من مزرعة مبيت لليلة واحدة وأضف واحد مللي لتر من مخزون الفيروس القهقري المضاف إليه poly green.

بعد حضانة لمدة ست ساعات، أضف 2 mL من 10%F-B-S-D-M-E-M إلى البئر وضع الأطباق في حاضنة عند 37 °C. وخلال الليل، قم بتجديد الوسط الغذائي، وبعد 24 ساعة، أضف الوسط الانتقائي المناسب؛ وعندما تصبح الخلايا متلاحمة، قم بحصاد الخلايا وفرزها بناءً على الفلورة باستخدام خلايا غير محولة كمرجع. اجمع الخلايا التي تظهر فلورة أعلى من الخلايا غير المحولة وجمد حصصاً منها عند -80 °C لاستخدامها مستقبلاً.

تعتمد هذه الطريقة على التعبير عن البروتينات الفلورية للتصور المرئي، وهي تتيح تحديد رؤى حول مساهمات الخلايا الفردية. قم بإذابة Matrigel بالكامل على الثلج، ثم خففه بنسبة واحد إلى واحد في PBS بارد جداً. الآن، قم بإدخال transwells غير المطلية في طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئراً.

بعد ذلك، قم بنقل 100 µL من الماتريجيل المخفف بعناية باستخدام الماصة إلى الآبار، واتركه ليتصلب عند 37 °C. وفي هذه الأثناء، قم بتحضير معلقات الخلايا المرمزة فلوروسنتياً في وسط نموها الطبيعي. وعندما يتصلب الماتريجيل، اقلب وحدات الترانسويل وانقل 100 µL من معلق الخلايا فوق الجانب السفلي للفلتر المواجه للمخرج.

قم بتغطية الآبار النفاذة (transwells) بعناية باستخدام قاعدة طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئراً، مع ضمان ملامسة كل قطرة من معلق الخلايا. احضن الطبق في حالة مقلوبة لمدة أربع ساعات للسماح بالتصاق الخلايا. الآن، اقلب الأطباق إلى وضعها الصحيح واغسل كل بئر نفاذ عن طريق غمسه في 1 mL من الوسط الخالي من المصل مرتين.

ثم ضع الـ transwell في بئر ثالث يحتوي على أي عقاقير أو كواشف علاجية. قم بنقل 100 µL من الوسط الذي يحتوي على جاذب كيميائي بعناية باستخدام الماصة إلى الـ transwell فوق خليط matrigel PBS المتصلب. يتم التحضين لمدة تتراوح من ثلاثة إلى خمسة أيام عند 37 °C مع 5% CO2 لتصوير الخلايا غير الفلورية التي تغزو الـ Matrigel.

ضع الحجيرات ذات الغشاء النفاذ (transwells) في أطباق جديدة مكونة من 24 بئراً، ثم انقل باستخدام الماصة 1 mL من محلول calcium AM بتركيز 4 µM فوق كل سدادة من الـ matri gel، مع السماح للمحلول بالتدفق على الجوانب لضمان التصبغ من الأعلى والأسفل. يتم التحضين لمدة ساعة واحدة عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% carbon dioxide. بعد ذلك، يتم التصوير باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy).

تتيح طريقة صبغ نمط الحياة الأولى هذه تصور أنماط الغزو. انقل كل transwell إلى لوحة 24 بئراً جديدة، وأضف 1 mL من 4% paraform aldehyde و0.2% triton X 100، ثم قم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة نصف ساعة. بعد الغسل ثلاث مرات باستخدام 1 mL من PBS، أضف RNAs A لمدة 30 دقيقة، ثم اغسل مرتين باستخدام PBS للتصور بتركيز 0.01 mg/mL.

يُخفف يوديد البروبيديوم في PBS ويُترك في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. تُغسل العينات ثلاث مرات باستخدام PBS. في هذه المرحلة، يمكن حفظ آبار Transwells المصبوغة بيوديد البروبيديوم في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة شهر واحد على الأقل.

تتطلب طريقة صبغ الخلايا الثانية التثبيت، ولكنها تتيح قياساً كمياً أسرع للغزو. باستخدام مجهر بؤري مقلوب، يتم وضع جهاز transwell مع كمية صغيرة من محلول PBS المتبقي على شريحة غطاء كبيرة فوق عدسة شيئية بقوة 20 مرة غير غامرة، ثم يتم التقاط مقاطع بصرية كل 10 إلى 15 ميكرون من قاع سدادة matrigel. يتم قياس مدى الغزو كمياً باستخدام الشرائح البصرية الفردية. كما يتم بناء مجسمات ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج مناسب مثل velocity في هذه السلسلة المذكورة من الشرائح البصرية، وقد صُبغت الخلايا باستخدام calcium am.

وكما هو متوقع، يقل عدد الخلايا التي تغزو من خلال المرشح مع زيادة المسافة. ويمكن قياس هذا الغزو كمياً. وتوفر عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد لغزو الخلايا تصويراً مرئياً لنمط الغزو.

إذا تم وسم الخلايا عن طريق التعبير عن البروتينات الفلورية، فيمكن تصور مواقع الخلايا ذات كل لون في إعادة بناء ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في هذا المنظر الجانبي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر المقاطع العرضية من خلال عملية إعادة البناء رؤى حول الآليات الجزيئية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام مقايسة غزو الخلايا هذه للحصول على معلومات عن عملية الهروب أكثر مما يمكن الحصول عليه باستخدام الطرق القياسية.