الهيكل العظمي مثنوية الشكل الجنس العضلات من البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الخصوصية الجندرية للاختلافات في ملفات البروتوم الخاصة بالعضلات الهيكلية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق فرم وتجنيس أنسجة العضلة ذات الرأسين العضدية (biceps brachy) من الفئران الذكور والإناث بشكل شامل لاستخلاص معظم البروتينات. بعد ذلك، تُوضع العينة على شريط جل IEF، وتُفصل البروتينات بناءً على نقطة التعادل الكهربائي الخاصة بها، يليه إجراء SDS page للفصل في البعد الثاني وفقاً للحجم؛ وبعد صبغ الهلامات وتصويرها، يتم مقارنة ملفات البروتوم لعينات عضلات الذكور والإناث، ثم تُستأصل البقع التي تظهر اختلافات جوهرية في الوفرة بين الجنسين.

وأخيراً، يتم هضم البروتينات الموجودة في سدادات الهلام باستخدام التربسين. تُستخلص الببتيدات الناتجة من الهلام وتُخضع لتحليل الكروماتوغرافيا السائلة النانوية ومطيافية الكتلة من أجل تحديد هويتها. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج توضح التعبير التفاضلي للبروتينات في حالتين تجريبيتين أو أكثر من خلال الفصل الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد والبروتوميات المعتمدة على مطيافية الكتلة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول خصوصية العضلات وفقاً للجنس، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على خلايا أو أنسجة أو أعضاء أو سوائل أخرى في حالات فسيولوجية مختلفة. ستقوم الدكتورة Kalina Diva، المدير الفني لمركز Smith College للبروتوميات، بشرح الإجراء. بعد عزل وتنظيف وتقطيع العضلات الهيكلية للفأر بمعدل 45 µL من محلول استخلاص منظم لكل جرام من النسيج (يرجى الرجوع إلى البروتوكول المكتوب لهذا ولجميع وصفات المحاليل المنظمة الأخرى)، يتم تجنيس النسيج سبع مرات لمدة 15 ثانية في كل مرة عند درجة حرارة 4 °C باستخدام مدقة آلية، مع التبريد على الثلج لمدة دقيقتين بين كل عملية تجنيس.

قم بطرد العينات مركزياً عند 15,800 Gs لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. احتفظ بالسائل العلوي وقم بقياس حجمه. تخلص من الراسب لترسيب البروتينات باستخدام ثلاثة أحجام من الثلج.

أضف أسيتون بارد بدرجة نقاء كيميائية (reagent grade) لكل حجم من الطافي. قم برج الأنابيب باستخدام جهاز Vortex لمدة 15 ثانية، ثم قم بالطرد المركزي عند 15,800 Gs لمدة 10 ثوانٍ لتكوين الرواسب. تخلص من الطافي وأعد تعليق الرواسب في محلول استخلاص (extraction buffer) باستخدام المدقة الآلية وقضبان تحريك من البولي بروبيلين، ثم قم بترسيب البروتينات مرة ثانية بإضافة ثلاثة أحجام إضافية من الأسيتون.

بعد إعادة تعليق الراسب في محلول الاستخلاص، حدد تركيز البروتين و/أو قم بتخزين العينات عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. لإجراء التركيز المتساوي الكهربائي للبروتينات، أخرج شريحة IPG جاهزة من المجمد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية واتركها لتتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 10 إلى 15 دقيقة. قم برج العينة بجهاز الفورتكس، ثم انقل بواسطة الماصة ما بين 600 إلى 800 micrograms من البروتين في خط مستقيم عند الحافة الخلفية للقناة في صينية إعادة ترطيب العينة، مع ترك حوالي 1 cm عند كل طرف.

باستخدام الملقط، قم بإزالة الغطاء البلاستيكي لشريط IPG، مع الحرص على إمساك طرفي الشريط فقط وتجنب أي تلامس مع الهلام. حدد الطرف المميز بعلامة الموجب في الشريط وضعه على الجانب الأيسر من الحوض. ضع شريط IPG بحيث يكون جانب الهلام لأسفل فوق العينة.

تجنب حبس الفقاعات في الأسفل. اتركها لترتوي لمدة ساعة واحدة. غطِّ الشريط بـ 2.5 milliliters من الزيت المعدني.

غَطِّ الصينية بغطاء واتركها لإعادة الترطيب طوال الليل. وفي اليوم التالي، وفي درجة حرارة الغرفة، ضع فتيلة ورقية عند كلا طرفي قناة تركيز التجارة وبلل كل واحدة منها بـ 10 µL من مياه millipore. قم بإزالة شريط IPG وأمسكه بشكل رأسي لمدة 10 ثوانٍ تقريبًا.

لتصريف الزيت، جفف الظهر البلاستيكي باستخدام منديل Kim wipe. ضع شريط IPG بحيث يكون جانب الهلام لأسفل والطرف القاعدي جهة اليسار. في صينية التركيز، غطِّ الشريط بـ 2.5 milliliters من الزيت المعدني.

ضع الصينية في خلية Protean IEF وقم ببرمجة بروتوكول مكون من ثلاث خطوات عند درجة حرارة خلية افتراضية تبلغ 20 °C، وبحد أقصى للتيار يبلغ 50 µA لكل شريط، ودون تخصيص وقت لإعادة الترطيب. بعد اكتمال البرنامج، انقل الشريط بحيث يكون موقع الجل للأعلى إلى صينية موازنة بحجم 11 cm. أضف 4 mL من محلول التخفيض إلى القناة وقم بموازنة الشريط لمدة 10 دقائق مع الرج الخفيف.

أزل محلول التخفيض وأضف أربعة مللي لتر من محلول الألكلة إلى القناة، ثم قم بموازنة الشريط عن طريق الرج لمدة 10 دقائق إضافية. اشطف شريط IPG عن طريق غمسه لفترة وجيزة في محلول تشغيل SDS بتركيز 1X. بعد ذلك، ضع الشريط بحيث يكون جانب الهلام للأعلى على اللوحة الخلفية لجهاز Criterion مقاس 11 سنتيمتر.

قم بإعداد هلام بولي أكريلاميد SDS-PAGE بتركيز 10.5 إلى 14%tris H-C-L-S-D-S مسبق الصب، وادفعه برفق لضمان التلامس الكامل مع هلام SDS. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة بين سطحي الهلام. قم بتغطية شريط IPG بـ 1 mL من محلول الآغاروز المصهور واتركه يتصلب لمدة خمس دقائق.

ثم يتم تحميل 5 µL من مؤشر البروتين في البئر المنفرد. يتم تشغيل الهلام في منظم SDS بجهد 200 فولت في درجة حرارة الغرفة، أو عند 4 °C. وعندما تصل جبهة الصبغة إلى أسفل الهلام، يتم إخراجه من القالب البلاستيكي وصبغه طوال الليل عن طريق رجه بلطف في صبغة كوماسي بريليانت الزرقاء.

رُجَّ الهلام في محلول إزالة الصبغة الأول مرتين لمدة ثلاث ساعات في كل مرة، ثم في محلول إزالة الصبغة الثاني طوال الليل. يُحفظ الهلام في حمض الخليك بتركيز 7% للتحليل. بعد تصوير الهلام وإجراء تحليل مقارن لأنماط البقع بين الأشكال الهلامية، وقص البقع المطلوبة، يُضاف 200 µL من محلول إزالة الصبغة إلى سدادات الهلام، ثم تُرج العينات باستخدام جهاز vortex وتُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع الرج.

بعد ذلك، قم بإزالة المحلول والتخلص منه بعناية وكرر العملية. أضف 30 µL من المنظم المختزل (reducing buffer) المحضر حديثاً إلى الأنابيب التي تحتوي على سدادات الهلام (gel plugs) واتركها في الحضانة عند 60 °C لمدة 10 دقائق. اترك العينات لتبرد.

بعد ذلك، قم بإزالة المحلول المنظم والتخلص منه. أضف 30 microliters من محلول الألكلة (Alkylation buffer) واحضن العينات في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، ثم قم بإزالة محلول الألكلة والتخلص منه. اغسل سدادات الهلام (gel plugs) بإضافة 200 microliters من محلول إزالة الصبغة (detaining solution) إلى كل أنبوب واحضن العينات عند 37 degrees Celsius لمدة 15 دقيقة.

قم بإزالة محلول التثبيت والتخلص منه ثم كرر عملية الغسل. بعد ذلك، أضف 50 µL من الأسيتونيتريل إلى سدادات الهلام واحضنها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح لها بالانكماش والجفاف. ثم قم بإزالة الأسيتونيتريل بعناية وكرر العملية على قطع الهلام.

يجب أن تبدو القطع بيضاء وصغيرة. اترك قطع الهلام لتجف في جهاز تركيز لمدة 10 دقائق. قم بنفخ قطع الهلام بإضافة 10 µL من محلول التربسين المنشط.

يتم التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف 25 µL من محلول الهضم المنظم (digestion buffer) إلى الأنابيب. تُحضن العينات في درجة حرارة الغرفة طوال الليل مع الرج، ثم تُعرض العينات للموجات فوق الصوتية (sonication) لمدة 10 دقائق وتُدوّر بجهاز الطرد المركزي لترسيب الشوائب قبل نقل السائل الطافي إلى أنبوب جديد.

لمزيد من استخلاص الببتيدات، أضف 10 µL من حمض الفورميك بتركيز 0.1% إلى السدادات واحضنها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج، ثم قم بإجراء سونيكة للعينات لمدة 10 دقائق. اجمع الطافي وادمجه مع الطافي الذي تم حفظه سابقاً. يمكن بعد ذلك إزالة الأملاح من البروتينات وتحضيرها لتحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء المقترنة بمطياف الكتلة (HPLC coupled mass spectrometry). تم استخلاص العضلات الهيكلية المرآتية غير المجهدة من الذكور والإناث وفصلها في خريطة ثنائية الأبعاد.

بعد تصور المستوى الأول من البروتوم المقارن للعضلات باستخدام التصوير الرقمي عالي الدقة، تم اكتشاف حوالي 800 بقعة بروتينية في كل منها كما هو موضح هنا. وباستخدام خريطة البروتوم للذكور كخط أساس، يتضح وجود العديد من البقع التي تتغير وفرتها في بروتوم الإناث؛ حيث تم تحديد البقع التي زادت بمقدار ضعفين أو أكثر في الإناث بدوائر حمراء، بينما حُددت البقع التي انخفضت بمقدار ضعفين أو أكثر بدوائر زرقاء. وقد تم تحديد هويات البقع البروتينية التي تغيرت بأكثر من ضعفين صعوداً أو هبوطاً وكانت ذات دلالة إحصائية مع عدد عينات N من خمسة فئران عن طريق تحليل تسلسل الأحماض الأمينية باستخدام تقنية الكروماتوغرافيا السائلة المقترنة بطيف الكتلة.

في هذا المخطط، يمثل المحور x إناث الفئران قبل التمرين، ويمثل المحور Y مجموعة نقطة زمنية واحدة عند الساعة صفر. وتظهر النتائج أن الإناث يظهرن انخفاضاً كبيراً في استقلاب طاقة السكر، والإنزيمات، وفي الأشكال الإنزيمية لـ creatine kinase التي تمثل نظام إمداد طاقة مختلف في العضلات. ويظهر كل من البشر والحيوانات مستويات serum CK أعلى لدى الذكور في حالة الراحة وبعد التمرين، ولكن مستويات serum CK لا ترتبط بالضرورة بكمية myo fibrillar.

يُعد هذا التباين الجنسي في الوفرة الخلوية لـ CK في عضلة ذات الرأسين العضدية لدى الفئران اكتشافاً جديداً، وقد يفسر الاختلاف الفسيولوجي في مستويات CK في المصل. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل اللطخة المناعية الكمية للتحقق من النتائج. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لدينا فهم جيد لكيفية تحضير وفصل العينات لتحليل المجموع البروتيني التفاضلي.