تحليل التعبير عن الأنواع الفرعية رابط-هيستون الثدييات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل مستويات تعبير الأنواع الفرعية للهيستون H1 من خلال تحليل مستويات mRNA للهيستون H1 وقياس مستويات بروتين H1. ولإتمام تحليل mRNA، يتم أولاً استخلاص RNA الكلي من الخلايا المستزرعة أو أنسجة الفأر. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إجراء عملية نسخ عكسي لـ RNA الكلي باستخدام بادئات عشوائية، يليها إجراء فحوصات PCR الكمي في الوقت الحقيقي لكل من جينات الأنواع الفرعية لـ H1. أما تحليل بروتين الهيستون H1 فيبدأ بتحضير مستخلصات الهيستون الكلية من أنسجة الفأر أو الخلايا المستزرعة.

يتبع ذلك تجزئة وتقدير كمي لكل نوع فرعي من H one والـ core histone H two B عن طريق تحليل HPLC بالطور المعكوس. وفي النهاية، يوضح تحليل quantitative real-time PCR وHPLC بالطور المعكوس مستويات تعبير كل من mRNA والبروتينات لكل نوع فرعي من H one.

نحن طلاب دراسات عليا في مختبر الدكتور Yuhan FES بكلية البيولوجيا في معهد جورجيا للتكنولوجيا. سنعرض لكم اليوم مجموعة من المقاييس الشاملة لتحليل تعبير H ones في الأنواع الفرعية لـ H one في الثدييات. ومن خلال هذه المقاييس، يمكنك الحصول على قياس كمي لمستويات تعبير كل من mRNA والبروتين في مختلف الأنواع الفرعية لـ H one.

يعد الهيستون H one البروتين الهيكلي الكروماتيني الرئيسي الذي يسهل طي الكروماتين من الرتب العليا، وتوجد نسخ متعددة من الهيستون H one يتم التعبير عنها بشكل تفاضلي أثناء تمايز الخلايا ونموها. إن تحليل ملفات التعبير لهذه الأنواع الفرعية من H one ضروري لفهم أفضل لتنظيم بنية ووظيفة الكروماتين من الرتب العليا. لذا، فلنبدأ.

قبل استخلاص RNA، يجب مسح جميع أسطح العمل والماصات باستخدام 70% ethanol ومعالجتها بمحلول إزالة تلوث RNA. تقلل هذه الممارسة من فرص تلوث RNA وتحلله. بالإضافة إلى ذلك، يجب ارتداء القفازات في جميع الإجراءات لبدء استخلاص RNA من المزارع الخلوية الملتصقة، حيث يتم سحب وسط الزرع وشطف الخلايا باستخدام PBS.

بعد ذلك، قم بإزالة PBS من الآبار. من الضروري توفير كمية كافية من كاشف triol للحصول على RNA عالي الجودة. استخدم 1 mL من كاشف triol لاستخلاص RNA من بئر واحد في طبق مكون من ستة آبار، ثم تابع استخلاص RNA من الخلايا وفقاً لدليل الشركة المصنعة لكاشف triol. بعد عملية استخلاص RNA، قم بقياس تركيز RNA باستخدام NanoDrop 1000.

تتراوح الحصيلة النموذجية ما بين 5 إلى 15 ميكروجرام من RNA لكل 1×10⁶ من الخلايا المستزرعة. وقبل البدء في تخليق cDNA، يتم تحليل جودة RNA عن طريق الفصل الكهربائي بهلام GE لاستبعاد احتمال تلوث RNA بكميات ضئيلة من DNA الجينومي؛ لذا تُعالج عينات RNA بـ DNase الخالي من RNA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لنسخ RNA الكلي عكسياً إلى cDNA. استخدم نظام تخليق الشريط الأول superscript 3 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. ونظراً لأن mRNA لمعظم جينات H1 يفتقر إلى ذيول poly A، فمن الضروري استخدام random hexamers بدلاً من oligo dT كبادئات.

بالنسبة لتخليق الـ CDNA، يمكن تحقيق تضخيم الـ CD NA بعد عملية النسخ العكسي من خلال الـ Q-R-T-P-C-R كما يتم الكشف عنها بواسطة صبغة cyber green قبل مقايسة الـ Q-R-T-P-C-R. تم تصميم بادئات PCR أمامية وعكسية خاصة بكل جين H one والجين المرجعي الداخلي، واختُبرت كفاءة البادئات باستخدام طريقة المنحنى القياسي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ابدأ بتحضير كل تفاعل PCR عن طريق خلط البادئات والـ CDNA والـ CYBERG green super.

امزج التفاعلات جيداً في طبق PCR من نوع micros EAL 96 بآبار، واستخدم أختام micros EAL B اللاصقة لضمان إحكام غلق غطاء الطبق على الطبق نفسه. ثم قم برج الطبق المختوم بجهاز vortex وقم بتدوير مخاليط التفاعل لفترة وجيزة لترسيب السوائل. ضع الطبق في نظام My IQ للكشف عن PCR في الوقت الحقيقي أحادي اللون لإجراء QPCR.

قم بضبط ظروف الـ QPCR وأجرِ التشغيل وفقاً للإرشادات الواردة في النص الذي يلي عملية التضخيم. افحص منحنيات التضخيم لتحديد كفاءة الـ PCR وقيم عتبة الدورة أو قيم CT. يمكن ضبط خط العتبة تلقائياً بواسطة برنامج النظام الضوئي IQ five الإصدار 2.0.

بما أن صبغة cyber green تكشف عن أي DNA مزدوج الشريط، فمن الضروري إجراء تشغيل لمنحنى الانصهار بعد عملية QPCR للتأكد من تضخيم وكشف قطعة الـ amplicon المطلوبة، وليس ثنائيات البادئات (primer dimers) أو الملوثات. وفيما يخص برنامج تحليل منحنى الانصهار، يقوم جهاز QPCR بتسخين العينات من 55 °C إلى 95 °C بزيادات قدرها 0.5 °C مع جمع البيانات. ونظرًا لأن درجة الحرارة أو درجة حرارة الانصهار TM لـ DNA مزدوج الشريط تعتمد على طول الـ amplicon ومحتوى GC، فإن قطع amplicons المختلفة سيكون لها درجات حرارة انصهار tms مختلفة.

افحص منحنيات الانصهار المشتقة لنواتج QPCR للتأكد من درجة حرارة الانصهار المحددة لمضاعفات الحمض النووي المطلوبة، وكذلك خلوها من قمم مضاعفات الضوضاء، مثل منحنيات الانصهار لمضاعفات H one A PCR الموضحة هنا بدرجة TM تبلغ 86 °C. انتقل إلى تحليل بيانات QPCR باستخدام برنامج نظام IQ five البصري. قم بتطبيع قيم التعبير عن جينات H one isoform مع التعبير عن الجينات المرجعية (housekeeping genes) للحصول على مستويات التعبير النسبي لجينات H one.

بعد تشريح العضو المطلوب من فأر تم القتل الرحيم له، اشطفه بمحلول PBS مبرد بالثلج. في هذا العرض التوضيحي، يتم تحضير المستخلصات الكلية من الكبد؛ فبعد الغسل، قم بتقطيع النسيج إلى قطع صغيرة باستخدام شفرة حلاقة. انقل النسيج المقطع إلى جهاز تجانس (homogenizer)، ثم أضف محلول السكروز المنظم إلى جهاز التجانس بحجم 10 milliliters لكل جرام من النسيج.

باشر بتجنيس النسيج من 10 إلى 15 ضربة. بعد نقل المتجانسات إلى أنبوب سعة 15 milliliter، قم بإجراء عملية طرد مركزي للعينات بسرعة 500 RPM لمدة 30 ثانية. بعد الطرد المركزي، انقل الطافي بعناية إلى أنبوب جديد وقم بإجراء طرد مركزي بسرعة 2000 RPM لمدة خمس دقائق.

لترسيب الخلايا، أعد تعليق كتلة الخلايا المترسبة في 10 milliliters من محلول السكروز المنظم، المدعم بـ 0.5%NP 40. انقل العينة إلى جهاز التجانس (homogenizer) وقم بإجراء 10 ضربات خلال فترة تحضين مدتها 20 minute. عند هذه النقطة، يتم الحصول على النوى.

افحص جودة النوى تحت المجهر. بعد ترييب النوى عن طريق الطرد المركزي بسرعة 2000 RPM لمدة خمس دقائق، يمكن التخلص من السائل الطافي. بعد ذلك، أعد تعليق ركاز النوى في ثلاثة مليليتر من منظم عالي الملوحة لكل جرام واحد من النسيج.

انقل العينة إلى مجانس صغير وقم بتجانسها من 5 إلى 10 مرات. صب المعلق في ثلاثة أنابيب إبندورف. قم بحضن الأنابيب على الثلج لمدة 20 دقيقة.

اتبع عملية الحضن بالقيام بالطرد المركزي بسرعة 14,000 RPM لمدة 10 دقائق لترسيب الكروماتين. بعد التخلص من السائل العلوي، استخلص الهيستونات الكلية بإضافة 0.8 milliliters من حمض الكبريتيك بتركيز 0.2 normal إلى كل راسب كروماتين. استخدم مدقة أنابيب einor لطحن الراسب جيداً حتى يتفكك الراسب تماماً.

حضّن العينات على منصة دوارة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. وبعد عملية الطرد المركزي، انقل السائل الطافي إلى أنبوبي EOR. أضف 2.5 حجم من الإيثانول المبرد بالثلج إلى كل أنبوب.

تُحفظ العينات عند درجة حرارة -20 °C طوال الليل، وفي اليوم التالي، تُوضع في جهاز الطرد المركزي بسرعة 14,000 RPM لمدة 10 دقائق لترسيب الهيستونات الكلية ثم يُتخلص من السائل الطافي. بعد غسل الراسب ثلاث مرات باستخدام 70% ethanol، تُترك الأنابيب المفتوحة على طاولة المختبر لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة لتجف في الهواء، ومن ثم يتم الانتقال إلى تحليل HPLC فوراً. يُعاد تعليق راسب الهيستونات في الحجم الموصى به من الماء المقطر مرتين بناءً على سعة عمود الطور المعكوس وجهاز HPLC، ثم تُوضع في جهاز الطرد المركزي بسرعة 14,000 RPM لمدة خمس دقائق.

لإزالة الرواسب غير القابلة للذوبان، يتم حقن 50 إلى 100 ميكروجرام من بروتين الهيستون الكلي في عمود الطور المعكوس لنظام HPLC، مثل GE ACTA purifier UPC 900. يجب تجنب تحميل كمية زائدة من البروتين لمنع انسداد العمود. يتم فصل الهيستونات والروابط والهيستونات الأساسية باستخدام تدرج متزايد من الأسيتونتريل كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، ويتم مراقبة التدفق عند 214 نانومتر مع تسجيل وتحليل ملفات HPLC. كما يمكن جمع كسور البروتين باستخدام مجمع الكسور التلقائي GE FRAC nine 20 لإجراء المزيد من التحاليل.

تظهر هنا منحنيات تضخيم نموذجية لتفاعلات H one A-Q-P-C-R باستخدام CDNA تم تحضيره من الكبد للفأر والخلايا الجذعية الجنينية للفأر. ويظهر تقييم مخطط التضخيم أن تفاعلات QPCR الثلاثية لكل عينة أعطت إشارات متسقة مع قيم CT متطابقة تقريبًا، مما يشير إلى قابلية تكرار عالية. كما يشير عدم تراكم النواتج التضخمية من تفاعلات RT minus QPCR إلى أن التلوث بالحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي كان غير موجود أو في حده الأدنى. وبناءً على قيم CT لجينات H one والجينات المرجعية، تم حساب مستويات التعبير النسبي لـ RNA لكل جين من جينات H one.

تُعد الرسوم البيانية المعروضة هنا أمثلة على النتائج المحسوبة لجيني H one A وH one zero. وتكون مستويات التعبير النسبي لـ H one A mRNA أعلى في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر مقارنة بكبد الفأر، بينما يكون التعبير عن H one zero أعلى بكثير في الكبد منه في الخلايا الجذعية الجنينية. كما يتضح الاختلاف في التعبير عن H one A أو H one zero في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر مقابل كبد الفأر البالغ من ملفات HPLC لبروتينات الهيستون.

H10. يتراكم البروتين H1 النوعي للتمايز بكميات كبيرة في كبد الفأر البالغ. وفي المقابل، يكون بروتين H10 غائباً تقريباً في الخلايا الجذعية الجنينية غير المتمايزة للفأر.

من ناحية أخرى، يتم التعبير عن H1A بشكل كبير في الخلايا الجذعية الجنينية، بينما يظهر بمستويات منخفضة في كبد الفأر البالغ من خلال قياس كمية قمم H1. وفي ملف HPLC، يتم تحديد النسبة النسبية لكل نوع فرعي فردي من H1 ضمن عائلة H1 في كبد الفأر البالغ. علاوة على ذلك، يمكن حساب قيم كل نوع فرعي من H1 لكل نيوكليوسوم من نسبة قيمة القمة المعيرة للامتصاص عند 214 nanometers للأنواع الفرعية المقابلة من H1 إلى نصف القيمة المعيرة لـ H2B. ويمكن حساب هذه القيمة بالمثل لإجمالي H1 لكل نيوكليوسوم.

بمجرد إتقان العملية، يمكن إجراء تحليل Q-R-T-P-C-R للنمط الفرعي H one في يوم واحد، بينما يمكن إتمام استخلاص الهستونات وتحليل HPRC في ثلاثة أيام إذا نُفذت الخطوات بشكل صحيح. وعند محاولة إجراء تحليل Q-R-T-P-C-R لجينات الهستون H one، من الضروري تجنب تحلل RNA والتخلص من تلوث DNA الجينومي، والأهم من ذلك إدراج البادئات العشوائية في تفاعل النسخ العكسي. أما خلال عملية استخلاص الهستون وتحليل HPOC، فمن المهم إضافة مثبطات البروتين حديثاً إلى محلول الاستخلاص لتجنب تحلل البروتين، كما يجب الاهتمام بتفكيك الكروماتين تماماً لتسهيل الاستخلاص الكامل للهستونات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية التحليل الشامل للتعبير عن الأنواع الفرعية لـ histo H one في الثدييات على مستويي mRNA والبروتين.