تعيش خلية من خلايا التصوير تعرب عن ترحيل البروتينات Fluorescently الموسومة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد

وقد جرت العادة على العمليات الخلوية مثل الهجرة الخلية درس على السطوح ثنائية الأبعاد ، والبلاستيك شديدة. هذا التقرير وصفا لأسلوب لتصور مباشرة توطين البروتين وتحليل ديناميات البروتين في الخلايا المهاجرة في مصفوفة أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية ثلاثي الأبعاد.

يهدف هذا العرض التوضيحي إلى تصوير البروتينات الموسومة بالفلورسنت في الخلايا الحية في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. أولا ، قم بإنشاء خطوط خلوية مستقرة تعبر عن البروتينات ذات العلامات الفلورية. قم بزرع هذه الخلايا في مصفوفة كولاجين ثلاثية الأبعاد ، ثم احصل على صور بفاصل زمني للخلايا المهاجرة باستخدام مجهر متحد البؤر.

في النهاية ، تضيء النتائج توطين البروتين وديناميكياته داخل الخلايا المهاجرة من خلال التصوير بفاصل زمني وتحليل FP ، ومراقبة ديناميكيات البروتين وتوطينه في 3D وفي الوقت الفعلي. يوفر وسيلة واحدة لمعالجة الأسئلة الأساسية في هجرة الخلايا. على سبيل المثال ، كيف يتم تنظيم جهات الاتصال اللاصقة بواسطة البروتينات السيتوبلازمية؟

وأيضا كيف تنزعج هذه الاتصالات من مثبطات معينة. في خلايا ثقافة الأطباق P 35 عند طلاقة مشتركة من 80 إلى 90٪ ، قم بنقل الخلايا بالبلازميد ذي الأهمية باستخدام lipo 2000 وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. ثم ضع الخلايا في حاضنة.

في اليوم التالي ، قسم الخلايا إلى طبقين من أطباق بتري واحتضانها طوال الليل. قم بتجديد الوسائط لإضافة 50 ميكروغراما لكل ملليلتر من G أربعة 18. يجب مواصلة الاستزراع تحت اختيار المضادات الحيوية لمدة أسبوعين.

افحص الثقافة الخاصة بمستعمرات مقاومة G four 18. ثم باستخدام مجهر الفلورسنت المقلوب. تحديد وتمييز مستعمرات GFP الإيجابية.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. بعد الغسيل الثاني ، اترك طبقة رقيقة من السائل لمنع الخلايا من الجفاف لكل مستعمرة محددة. امسح بالقرب من الحافة بقطعة قطن معقمة وماصة 10 ميكرولترات من التربسين على المستعمرة.

كرر بسرعة لكل مستعمرة. ثم احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لانفصال الخلية. تحقق من المظهر الدائري تحت المجهر.

أضف 10 ميكرولترات من التربسين إلى كل مستعمرة ، ماصة لفصل الخلايا تماما عن اللوحة. ثم انقل كل مستعمرة من الخلايا إلى بئر واحد من 24 بئر مزرعة لتضخيم المستعمرات المستقرة. بعد ذلك ، قم بتقييم التعبير البروتيني للمستعمرات باستخدام اللطخة الغربية القياسية والتألق المناعي.

قم بتوسيع خطوط الخلايا المحددة لتعديل سطح الزجاج. يوفر الطبق السفلي ربط الكولاجين الأمثل. ماصة 300 ميكرولتر من محلول الانزلاق على الجزء الزجاجي من كل طبق P 35 بفتحة 10 ملم.

احتضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. استنشق المحلول واغسله بالماء المصفى ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما. قم بإزالة الماء وضع الأطباق على طبق ساخن 50 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.

ضع قمم الأطباق بعيدا قليلا عن الطبق للسماح بالتجفيف. بعد أن تبرد الأطباق الجافة ، ضع الماصة 300 ميكرولتر من محلول الجلوتارالديهايد بنسبة 2٪ على الجزء الزجاجي من كل طبق. احتضنها لمدة ساعة ، ثم اغسلها ب PB S3 مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما.

استمر في تعقيم الأطباق عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة. الحبيبات الأولى 100 ميكرولتر من جزيئات تتبع الفلورسنت عن طريق الطرد المركزي. تخلص من السائل وأعد تعليق الجسيمات في 500 ميكرولتر من الوسائط.

قم بإجراء خمس غسلات ، ثم أعد تعليق الجسيمات في 30 ميكرولتر من الوسائط. بعد ذلك ، قم بحصاد الخلايا التي تعبر عن GFP باستخدام التربسين وقم بإعداد تعليق من 2 مليون خلية لكل مليلتر في أنبوب einor ماصة 240 ميكرولتر من وسائط النمو. أضف 12.6 ميكرولتر من أكوام مولية واحدة ، و 20 ميكرولترا من الماء المصفى ، و 50 ميكرولترا من محلول الخلية ، و 10 ميكرولترا من جزيئات الفلورسنت.

أخيرا ، أضف 167 ميكرولترا من كولاجين الأدمة البقرية ، محلول واحد يمزج محلول جيدا. الآن انقل 80 ميكرولترا إلى الجزء الزجاجي من الطبق المنعزل المجهز. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة حتى يتبلمر الجل.

ثم أضف بعناية ملليلترين من وسائط النمو. موازنة غرفة المجهر إلى درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية لتجديد وسط الخلية. للحفاظ على درجة حموضة محايدة لتصوير DIC ، استبدل الجزء العلوي من الطبق بسطح زجاجي بشريط رفيع من الطفيلي.

قم بتغطية جانب الطبق لمنع التبخر لغرض غمر الزيت. ضع قطرة واحدة من سائل الغمر على موضع الهدف. جل الكولاجين الذي يحتوي على الطبق على مرحلة المجهر بحيث يتلامس الطبق مع سائل الغمر.

ركز العينة وابحث عن الخلايا التي تهم الصورة لتقليل انحراف المرحلة. اترك الطبق يستقر لمدة 45 دقيقة. قبل البدء في التقاط طويل ، حدد معلمات الحصول على الصور لتجارب إضافة المثبطات.

تحضير الوسائط المكملة بالدواء بتركيز العمل المطلوب. قم بتجديد وسط الخلية للحفاظ على درجة حموضة محايدة ، لكن لا تغلق بالبيرفيل. انقل العينة إلى المجهر وتابع التصوير في وقت العلاج بتعاطي المخدرات.

أوقف الصورة مؤقتا ، والتقط الجزء العلوي من الطبق وأزله بعناية دون إزعاج الطبق. استنشق الوسائط وقم بإدخال الماصة التي تحتوي على وسائط الدواء في الطبق. ثم استبدل الطبق بعناية.

يختلف إعداد frap العلوي بين الأنظمة. لذا استشر تعليمات الشركة المصنعة. أولا تعيين معلمات لتصوير الخلايا الحية.

للتبييض الضوئي. اختبر هذه المعلمات على خلايا الممارسة للحصول على طاقة ليزر كافية لتبييض إشارة الفلورسنت دون الإضرار بالخلية. بعد ذلك ، ابدأ التقاط الصورة على العينة للحصول على خمسة إطارات على الأقل.

ثم التبييض الضوئي منطقة الاهتمام. استمر في الالتقاط خلال وقت الاسترداد. قم بقياس متوسط شدة الفلورسنت للمنطقة المبيضة بالصور قبل وبعد التبييض الضوئي بمرور الوقت ، باستخدام برنامج تحليل إحصائي.

قم بملاءمة منحنى الاسترداد مع المعادلة الأسية. احصل على معلمات الشوط الأول والشدة النهائية من منحنى الملاءمة الأسي. ثم احسب الكسر المتحرك بأخذ نسبة شدة التألق النهائية إلى الأولية.

تظهر صور الخلايا الحية ثلاثية الأبعاد هذه الخلايا الظهارية السليمة التي تعبر عن الأكتين GFP. بعد أربعة أيام من الثقافة ، شكلت هذه الخلايا كيسا في مصفوفة كولاجين ثلاثية الأبعاد. هاجرت بعض الخلايا على طول سطح الكيس بينما هاجر البعض الآخر داخل الكيس.

تحليل تشوه المصفوفة نتيجة لقوى الجر التي تمارسها الخلايا المهاجرة من خلال إزاحة جزيئات التتبع المضمنة في المصفوفة المحيطة. يظهر هنا تأثير تثبيط RO kinase على قوة الجر. يتم عرض حركات جسيمات التتبع كصورة إسقاط قصوى لنقاط زمنية مختلفة وكل نقطة زمنية ملونة زائفة.

بدلا من ذلك ، يتم عرض صور جسيم التتبع الفردي كمونتاج لإظهار حركة جسيم التتبع. بمرور الوقت ، تحرك جسيم التتبع هذا نحو الحافة الخلفية للخلية المهاجرة وبعيدا عنها قبل وبعد إضافة Y 2 7 6 3 2 على التوالي. يتبع تحليل frap الخلايا التي تعبر عن الأكتين GFP أثناء هجرتها في مصفوفة ثلاثية الأبعاد تشير إلى التعافي النموذجي من التألق بعد تجربة التبييض الضوئي في إعدادات الليزر المحسنة ، تتضاءل شدة التألق في المنطقة ذات الاهتمام بشكل واضح مقارنة بمستوى الخلفية مع الحفاظ على الخلايا السليمة وغير التالفة.

يوضح هذا الرسم البياني ملاءمة منحنى الاسترداد مع دالة أسية. بمجرد إتقانها ، قد يستغرق زرع الخلايا في المصفوفة ساعة. لا تنس أن العمل مع ثلاثة أمينو بروبيل ثلاثي الميثيل يمكن أن يكون خطيرا للغاية.

لذا اتخذ الاحتياطات مثل العمل في الغطاء الكيميائي. تذكر أيضا الحفاظ على ظروف معقمة عند العمل مع الخلايا في مصفوفة ثلاثية الأبعاد.