تعيش خلية من خلايا التصوير تعرب عن ترحيل البروتينات Fluorescently الموسومة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد

يهدف هذا العرض التوضيحي إلى تصوير البروتينات الموّسمة فلورياً في خلايا حية ضمن مصفوفة ثلاثية الأبعاد. أولاً، يتم إنشاء خطوط خلوية مستقرة تعبر عن بروتينات موّسمة فلورياً. تُزرع هذه الخلايا في مصفوفة كولاجين ثلاثية الأبعاد، ثم تُؤخذ صور بنظام التصوير الزمني (time-lapse) للخلايا المهاجرة باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope).

في نهاية المطاف، تسلط النتائج الضوء على تموضع البروتين وديناميكياته داخل الخلايا المهاجرة من خلال التصوير بنظام الفاصل الزمني وتحليل البروتينات الفلورية (FP)، مما يتيح مراقبة ديناميكيات البروتين وتموضعه ثلاثي الأبعاد وفي الوقت الفعلي. ويوفر ذلك مساراً لمعالجة الأسئلة الجوهرية في هجرة الخلايا؛ على سبيل المثال، كيف يتم تنظيم الاتصالات الالتصاقية بواسطة البروتينات السيتوبلازمية؟

وكيف تتأثر هذه الاتصالات بمثبطات محددة. في طبق P 35، يتم استزراع الخلايا بكثافة تتراوح بين 80 إلى 90%، ثم يتم ترانسفكشن الخلايا بالبلازميد المطلوب باستخدام lipo 2000 وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك، توضع الخلايا في الحاضنة.

في اليوم التالي، يتم تقسيم الخلايا إلى طبقين بتري من نوع P one 50 وتحضينها طوال الليل. يتم تجديد الوسط الغذائي لإضافة 50 micrograms per milliliter من G four 18. تستمر الزراعة تحت تأثير الانتخاب بالمضادات الحيوية لمدة أسبوعين.

افحص المزرعة بحثاً عن مستعمرات مقاومة لـ G four 18. ثم باستخدام مجهر فلوري مقلوب، حدد المستعمرات الموجبة لـ GFP وقم بتمييزها.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. بعد الغسلة الثانية، اترك طبقة رقيقة من السائل لمنع جفاف الخلايا في كل مستعمرة محددة. امسح المنطقة المحيطة بالحافة قدر الإمكان باستخدام مسحة قطنية معقمة، ثم انقل 10 µL من trypsin فوق المستعمرة.

كرر العملية بسرعة لكل مستعمرة. بعد ذلك، قم بتحضين الطبق عند 37 °C لفصل الخلايا. تحقق من المظهر المستدير تحت المجهر.

أضف 10 µL من التربسين إلى كل مستعمرة، واستخدم الماصة لفصل الخلايا تماماً عن الطبق. بعد ذلك، انقل كل مستعمرة من الخلايا إلى عين واحدة من طبق زراعة يحتوي على 24 عيناً لتكثيف المستعمرات المستقرة. ثم، قم بتقييم التعبير البروتيني للمستعمرات باستخدام تحليل ويسترن (western blot) القياسي والتألق المناعي.

قم بتوسيع الخطوط الخلوية المختارة عن طريق تعديل سطح الزجاج. يوفر الجزء السفلي من الطبق ارتباطاً مثالياً بالكولاجين. قم بنقل 300 µL من محلول السيليلزة إلى الجزء الزجاجي من كل طبق P 35 بفتحة تبلغ 10 mm.

تُحضن العينات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يُسحب المحلول بالشفط وتُغسل بالماء المفلتر ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. يُزال الماء وتوضع الأطباق على لوح تسخين بدرجة حرارة 50 degrees centigrade لمدة 1.5 ساعة.

ضع أغطية الأطباق مزاحة قليلاً عن الأطباق للسماح بالجفاف. بعد أن تبرد الأطباق الجافة، انقل بواسطة الماصة 300 µL من محلول glutaraldehyde بتركيز 2% على الجزء الزجاجي من كل طبق. حضّن العينات لمدة ساعة واحدة، ثم اغسلها بمحلول PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة.

باشر بتعقيم الأطباق بتعريضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة. أولاً، قم بترسيب 100 µL من جزيئات التتبع الفلورية عن طريق الطرد المركزي. تخلص من السائل وأعد تعليق الجزيئات في 500 µL من الوسط الزرعي.

أجرِ خمس عمليات غسل، ثم أعد تعليق الجسيمات في 30 µL من الوسط الغذائي. بعد ذلك، قم بحصاد الخلايا التي تعبر عن GFP باستخدام التربسين وجهز معلقاً بتركيز 2 مليون خلية لكل mL في أنبوب إينور. اسحب 240 µL من وسط النمو باستخدام الماصة. أضف 12.6 µL من HEPES بتركيز 1 M، و 20 µL من الماء المفلتر، و 50 µL من محلول الخلايا، و 10 µL من الجسيمات الفلورية.

أخيراً، أضف 167 µL من كولاجين أدمة البقر، وهو المحلول رقم واحد، وامزج المحلول جيداً. الآن، انقل 80 µL إلى الجزء الزجاجي من الطبق المـسيلوزد المُجهز. يتم التحضين عند 37 °C لمدة 50 دقيقة حتى يتبلمر الهلام.

ثم أضف مليليترين من وسط النمو بعناية. قم بموازنة غرفة المجهر لتصل إلى درجة حرارة مستقرة تبلغ 37 °C لإعادة ملء وسط الخلايا. وللحفاظ على درجة pH متعادلة من أجل التصوير بتقنية DIC، استبدل غطاء الطبق بغطاء زجاجي مع شريط رفيع من البارافورم.

قم بتغطية جانب الطبق لمنع التبخر عند استخدام عدسة شيئية غمر زيتية. ضع قطرة واحدة من سائل الغمر على موضع العدسة الشيئية. ضع الطبق الذي يحتوي على جل الكولاجين على منصة المجهر بحيث يتلامس الطبق مع سائل الغمر.

قم بضبط بؤرة العينة والبحث عن الخلايا المستهدفة للتصوير لتقليل انزياح المنصة. اترك الطبق ليستقر لمدة 45 دقيقة تقريبًا. قبل البدء في عملية التقاط طويلة، حدد معلمات الحصول على الصور لتجارب إضافة المثبط.

قم بتحضير الأوساط الغذائية المكملة مع الدواء بالتركيز التشغيلي المطلوب. قم بتجديد الوسط الخلوي للحفاظ على قيمة pH متعادلة، ولكن لا تغلقه باستخدام فيلم perfil. انقل العينة إلى المجهر وابدأ في التصوير عند وقت المعالجة بالدواء.

قم بإيقاف الصورة مؤقتاً، ثم ارفع غطاء الطبق بحذر دون تحريك الطبق نفسه. اسحب الوسط المزرعي باستخدام الشفاط، ثم انقل الوسط الذي يحتوي على العقار إلى الطبق بواسطة الماصة. بعد ذلك، أعد الغطاء إلى مكانه بعناية.

يختلف إعداد الـ frap العلوي بين الأنظمة، لذا يرجى مراجعة تعليمات الشركة المصنعة. أولاً، قم بتعيين المعلمات الخاصة بتصوير الخلايا الحية.

لعملية التبييض الضوئي. اختبر هذه المعايير على خلايا تجريبية للحصول على طاقة ليزر كافية لتبييض الإشارة الفلورية دون إتلاف الخلية. بعد ذلك، ابدأ بالتقاط الصور للعينة مع الحصول على خمس إطارات على الأقل.

بعد ذلك، قم بإزالة اللون الضوئي (photobleach) من المنطقة المستهدفة. استمر في الالتقاط خلال فترة الاستعادة. قم بقياس متوسط شدة الفلورة للمنطقة التي تمت إزالة لونها الضوئي قبل وبعد عملية إزالة اللون الضوئي عبر الزمن، وذلك باستخدام برنامج للتحليل الإحصائي.

قم بمطابقة منحنى الاستعادة مع المعادلة الأسية. استخرج معاملات نصف العمر والشدة النهائية من منحنى المطابقة الأسية. ثم احسب الكسر المتحرك عن طريق حساب نسبة شدة الفلورة النهائية إلى الشدة الأولية.

تظهر صور الخلايا الحية ثلاثية الأبعاد هذه خلايا ظهارية سليمة تعبر عن البروتين GFP actin. وبعد أربعة أيام من الزرع، شكلت هذه الخلايا كيسة في مصفوفة كولاجين ثلاثية الأبعاد. وقد هاجرت بعض الخلايا على طول سطح الكيسة، بينما هاجرت خلايا أخرى داخل الجزء الداخلي من الكيسة.

يتم تحليل تشوه المصفوفة الناتج عن قوى السحب التي تبذلها الخلايا المهاجرة من خلال إزاحة الجسيمات المتتبعة المدمجة في المصفوفة المحيطة. يظهر هنا تأثير تثبيط إنزيم RO kinase على قوة السحب. وتُعرض تحركات الجسيمات المتتبعة كصورة إسقاط قصوى لنقاط زمنية مختلفة، حيث تم تلوين كل نقطة زمنية بألوان اصطناعية.

بدلاً من ذلك، تُعرض صور جسيم تتبع فردي على هيئة تجميع صور (montage) لإظهار حركة جسيم التتبع. وبمرور الوقت، تحرك جسيم التتبع هذا نحو الحافة الخلفية للخلية المهاجرة ثم ابتعد عنها قبل وبعد إضافة Y 2 7 6 3 2 على التوالي. يتبع تحليل frap الخلايا التي تعبر عن GFP actin أثناء هجرتها في مصفوفة ثلاثية الأبعاد، مما يشير إلى استعادة نموذجية للفلوورسنس. وبعد تجربة التبييض الضوئي (photo bleaching) باستخدام إعدادات ليزر محسنة، تنخفض شدة الفلورة في المنطقة المستهدفة بشكل ملحوظ مقارنة بمستوى الخلفية مع الحفاظ على سلامة الخلايا وعدم تضررها.

يوضح هذا الرسم البياني مطابقة منحنى الاستعادة مع دالة أسية. بمجرد إتقان العملية، يمكن أن يستغرق استزراع الخلايا في المصفوفة ساعة واحدة. لا تنسَ أن التعامل مع three amino propyl trimethyl قد يكون خطيراً للغاية.

لذا، اتخذ الاحتياطات اللازمة مثل العمل داخل غطاء سحب الغازات الكيميائية. تذكر أيضاً الحفاظ على الظروف المعقمة عند التعامل مع الخلايا في مصفوفة ثلاثية الأبعاد 3D matrix.