Name: أميد الهيدروجينية / الديتريوم الطيف الكتلي تبادل و- TOF MALDI تحليل Pak2 التنشيط (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: اكتشف كيفية استخدام طيف الكتلة MALDI-TOF لمراقبة تبادل الهيدروجين/الديوتيريوم أثناء تنشيط بروتين كيناز Pak2. توفر هذه الطريقة رؤى قيمة حول ديناميكيات البروتين وتغيرات التركيب ثلاثي الأبعاد.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويدعم هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح GM - 26738 (لجات).

1. Pak2 التنشيط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المناسبة قبل اختبار كمية caspase 3-20 ميكرولتر من Pak2 ملغ / مل في 12 ألف والعازلة (50 ملي ملي تريس DTT - حمض الهيدروكلوريك وكلوريد الصوديوم 150 ملم ، و 2 في درجة الحموضة 7.5) في احتضان لمدة 30 دقيقة 34 درجة مئوية ليلتصق تماما وPak2 تنشيط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل المنتجات التي تشطر SDS - PAGE (10 ٪) ، وتلطيخ Coommassie زرقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى تفعيل Pak2 المشقوق العازلة ب (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك وكلوريد الصوديوم 150 ملم ، 15 ملم MgCl 2 و 10 ملي ATP) عند pH 7.5 ، في 20 ميكروليتر إلى التركيز النهائي للPak2 ملغ / مل 10 و 34 في احتضان درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتنشيط تماما Pak2 بواسطة autophosphorylation في 8 مواقع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد الانقسام الكامل Pak2 من جراء الهجرة من شظايا p34 P27 وعلى النحو الذي يحدده SDS - PAGE 10. يتم التحقق من الشروط المناسبة autophosphorylation عبر تصوير الإشعاع الذاتي في تجربة منفصلة باستخدام (32 ف) للاعبي التنس المحترفين أو قياس الطيف الكتلي لكشف phosphopeptides. </li></ol> 2. تحديدمن البيبسين - إستفتاء Pak2 شظايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من حمض Trifluroacetic 0.1 ٪ (TFA) في درجة الحموضة 2.5 لغسل حبات agarose مرتين قبل استخدامها. ثم الطرد المركزي العينات لمدة 15 ثانية في 2000 لإزالة XG الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة Pak2 (20 ميكروغرام في 2 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 150 مم ، 50 ملي ملي تريس DTT - 2 في حمض الهيدروكلوريك ودرجة الحموضة 7.5) إلى 100 ميكرولتر من TFA 0.1 ٪ ، واحتضان العينة لمدة 5 دقائق مع 30 ميكرولتر من الخرز agarose البيبسين ، مترافق . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن عكس العمود هبلك المرحلة C18 مع النظام الأساسي للمذيب TFA 0.1 ٪ عند pH 2.5. الخلاصة هي eluted البيبسين (50 ميكرولتر) باستخدام خطي 100 دقيقة من الانحدار 0-80 ٪ أسيتونتريل تحتوي TFA 0.1 ٪ في معدل التدفق من 0.2 مل / دقيقة. يتم جمع الكسور كل دقيقة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف الكسور HPLC مع بطالة السرعة (3 ح) و resuspend العينات في حل أسيتونتريل (5 ميكرولتر) وTFA 0.1 ٪ (5 ميكرولتر) عند pH 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البداية ، يتم فحص كل جزء لالببتيدات باستخدام - TOF MALDI PerSeptive النظم البيولوجية STR DE فويجر (PE بيosystems ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التي يتعرض لها الكسور التي تحتوي على 16 الببتيدات لمطياف الكتلة جنبا إلى جنب باستخدام مطياف الكتلة Q - TOF وXL QSTAR oMALDI MS / MS لتحديد الأجزاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التحقق من تسلسل من كل من أيونات الببتيد المنتجات التي تم إنشاؤها بواسطة مطياف الكتلة جنبا إلى جنب مع نسب م / ض النظرية القائمة على التسلسل الرئيسي للPak2 باستخدام بروتين موقع المنقب ( <a href="http://prospector.ucsf.edu/">http://prospector.ucsf.edu/</a> ) 11. </li></ol> 3. قياس صرف H / D الأميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعقد كل الحلول والكواشف اللازمة لH / D الصرف عند 25 درجة مئوية في حمام مائي. يذوب في الماء ATP ، ويتم تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 قبل الاستخدام. الإضافية 4mM ATP في المنطقة العازلة D O 2 هو لمنع فصلها عن ATP Pak2 بعد التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء H / D تبادل باضافة 18 ميكرولتر من مخزنة O 2 D (50 درجة الحموضة 6.98 ملي اجتماعات الأطراف ، 125 ملي مول كلوريد الصوديوم) إلى 2 ميكروليتر (20 ميكروغرام) من Pak2 في العازلة التي تحتوي على كلوريد الصوديوم 150 ملم ، 50 ملم DTT ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) و 2 ، مما أدى إلى مستوى Pak2 من 10 ملغ / مل ، ودرجة الحموضة من 7.0 في 0 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات في ثلاث نسخ في تبادل H / D ل0.5 ، 0 ، 1 ، 3 ، 5 و 10 دقيقة ، أو 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخماد عملية التبادل H / D بإضافة 180 ميكروليتر من الجليد الباردة TFA 0.1 ٪ عند pH 2.2 ، مما يجعل الرقم الهيدروجيني إلى 2.5 في الحجم النهائي من 200 ميكروليتر. للعينات التي تحتوي على ATP ، 180 ميكروليتر من الجليد الباردة TFA 0.11 ٪ عند pH 2.2 يستخدم للحفاظ على درجة الحموضة عند 2.5 في حالة مروي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قسامة (100 ميكرولتر) لكل عينة من مروي إلى 30 ميكرولتر من الخرز تنشيط agarose البيبسين ، مترافق. ولا يسمح للهضم الببسين والمضي قدما على الجليد لمدة خمس دقائق وvortexed العينات كل 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنهاء عملية الهضم بواسطة الطرد المركزي للعينة لمدة 15 ثانية في 5000 XG عند 4 درجة مئوية لإزالة البيبسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد بسرعة في عينات السائل N 2 وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 2قبل MALDI - TOF تحليل أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصفوفة لMALDI هو 5 ملغ / مل من α - cyano - 4 - hydroxycinnamic حمض (CHCA) الذائب في محلول (01:01:01) من الإيثانول ، وأسيتونتريل TFA 0.1 ٪ عند pH 2.5 والذي عقد في 0 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسن جزئيا كل عينة بسرعة ومزيج 1 ميكرولتر من كل عينة مع 1 ميكرولتر من المصفوفة والبقعة على 4 درجات مئوية لوحة الهدف MALDI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق فراغ معتدلة الى لوحة لتجفيف بقع في 30 ثانية قبل MALDI - TOF التحليل. الوقت بين ذوبان العينة واسترجاع الطيف حوالي 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اكتساب - TOF MALDI أطياف الشامل مع النظم البيولوجية STR PerSeptive DE فوياجر. الحصول على البيانات بمعدل أخذ العينات 2 غيغاهيرتز في قنوات البيانات 100000 ، مع الجهد 20000 - V المتسارع ، والجهد الشبكة 65 ٪ باستخدام تأخر استخراج مع تأخير النبض 180 نانوثانية. وبلغ متوسط ​​مائة بمسح في 2 دقيقة. لا يقتصر هذا الصك MALDI - TOF إلى أي علامة تجارية أو أي برنامج معين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الكمبيوتر البيانات إكسبلورر 4.0 برنامج لcalculتناولوا معالجة بالديوتريوم كل جزء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتساب الصرف مرة أخرى على أساس نسبة من العدد الفعلي دوتيرون أدرجت في 24 ساعة من H / D تبادل مقسوما على جميع المواقع المحتملة للتبديل ، والتي هي العمود الفقري الأميدات باستثناء أميد N - محطة (الشكل 1). </li></ol> 4. ممثل النتائج : يتم التحقق من الانقسام وcaspase autophosphorylation بواسطة تلطيخ Commassie SDS - PAGE. Pak2 الخاملة هي فرقة واحدة من 58 كيلو دالتون. Caspase تشطر من Pak2 كاملة ، وينتج اثنين الشظايا ، p34 P27 والتي تهاجر بشكل منفصل. هجرة يبين P27 وp34 autophosphorylated تداخل على هلام بسبب الهجرة من المتخلفين جزء فسفرته P27 بالكامل (الشكل 2). وتنفذ H / D تبادل التجارب خارج عدة مرات بين 0 و 10 دقيقة (الشكل 3). كمثال على ذلك ، فإن دوام التأسيس الديوتيريوم في م / ZPوتتألف من eak 1697.85 Pak2 نشط من النظائر قمم متعددة كما هو مبين في التحول من المغلف الشامل مع مرور الوقت. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig1.jpg" /> الشكل 1. المعادلات لحساب معالجة بالديوتريوم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig2.jpg" /> الشكل 2. Autophosphorylation والانقسام caspase من Pak2. وقد تم تحليل كاسباس المشقوق Pak2 (حارة اليسار) ، Pak2 نشط سليمة (وسط حارة) وكاسباس المشقوق Pak2 autophosphorylated (حارة اليمين) بواسطة SDS - PAGE وCoommassie تلطيخ زرقاء. مقتبس من هسو ، وآخرون YH 2. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3602/3602fig3.jpg" /> الشكل 3. الطيف كتلة من دورة الوقت التأسيس لالديوتيريوم Pak2 الخاملة. تعرض Pak2 الخاملة إلى H / D exchaنجى ل00-10 دقيقة وتحليلها بواسطة MALDI - TOF. ويرد مثال على توزيع النظائر الموسع - TOF MALDI ذروة م / ض 1697.85 خلال وقت H / D الصرف. الخط الأحمر المنقط يشير متوسط ​​المغلف الشامل والتحول من المغلف الشامل يبين معالجة بالديوتريوم من الببتيد.

<ol><li>Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amide+H%2F2H+exchange+reveals+communication+between+the+cAMP+and+catalytic+subunit-binding+sites+in+the+R%28I%29alpha+subunit+of+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22A.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase.</a> A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).</li>
<li>Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+conformational+changes+during+activation+of+protein+kinase+Pak2+by+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange.</a> J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).</li>
<li>Englander, S. W., Kallenbach, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+and+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids.</a> Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).</li>
<li>Dennis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localizing+the+membrane+binding+region+of+Group+VIA+Ca2%2B-independent+phospholipase+A2+using+peptide+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).</li>
<li>Hsu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+binding+rigidifies+the+C2+domain+and+the+intradomain+interaction+of+GIVA+phospholipase+A2+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).</li>
<li>Lee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+hPAK65+by+caspase+cleavage+induces+some+of+the+morphological+and+biochemical+changes+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).</li>
<li>Rudel, T., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+morphological+changes+in+apoptotic+cells+regulated+by+caspase-mediated+activation+of+PAK2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2.</a> Science. 276, 1571-1574 (1997).</li>
<li>Roig, J., Traugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+p21+G+protein-activated+protein+kinase+gamma-PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Vitam.+Horm%22%5BJournal%5D)">Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK.</a> Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).</li>
<li>Walter, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+activation+of+p21-activated+protein+kinase+gamma-PAK+by+CPP32+%28caspase+3%29.+Effects+of+autophosphorylation+on+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity.</a> J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).</li>
<li>Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+accurate+mass+measurement+%28%2B%2F-+10+ppm%29+in+protein+identification+strategies+employing+MS+or+MS%2FMS+and+database+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching.</a> Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

التعرف على أجزاء البيبسين - إستفتاء هو خطوة حاسمة لتبادل التجربة H / D. ويمكن تحديد صحيح لالببتيد تؤدي إلى استنتاج خاطئ. هو eluted Pak2 البيبسين هضم من خلال عمود المرحلة HPLC عكس C18 للحصول على خلفية نظيفة. في تجاربنا ، تم جمع ما مجموعه 40 وتعرض لكسور MALDI - TOF. ويمكن تحديد الببتيد متعددة في كل من الكسور. تعرضت الببتيدات إلى جنب الطيف الكتلي (Q - TOF MS / MS وoMALDI MS / MS) لتحديد تسلسل الخاصة بهم. ينبغي للأطياف MS / MS من الببتيد والأيونات المنتج لا يقل عن ثلاثة لتأكيد هوية من الببتيد. بيانات الكمبيوتر 4.0 مستكشف البرنامج (النظم البيولوجية التطبيقية) بتنفيذ تصحيح الأساس الأولي وترشيح الضوضاء. ويجب معايرة كل الطيف استنادا الى اثنين من قمم متتالية. نحن لدينا من قبل طيف ومعايرة الكتلة النظري للundeuterated م / ض والتي هي 923.45 1697.84. Tيستطيع دقة الشامل بعد معايرة تصل الى 10 جزءا في المليون. عند معالجة بالديوتريوم ، قد أحادي النظائر التحول إلى أعلى الشامل. حققت زيادات خطوة وحدوية لهذه النسب م / ض الجماهير تعزيز المرتبطة معالجة بالديوتريوم. فإن شدة ذروة المغلف الشامل لا تؤثر على مستوى معالجة بالديوتريوم. ومع ذلك ، فإن شدة ذروة الذرى النظائر في ظرف معين كتلة حرجة لحساب كتلة المتوسط. الخطوة الأولى من حساب دوتيرون أدرجت هو طرح كتلة الببتيد من العينة غير deuterated من العينة deuterated. وهناك ثلاثة عوامل أخرى ، في تخفيف D O 2 ، deuterons المتبقية في السلاسل الجانبية وتبادل الظهر ، الحاجة إلى مزيد من النظر في حساب (الشكل 1). التخفيف D O 2 هو عامل إضعاف D 2 O بعد خلط العينة وD O 2 العازلة للشروع في تبادل H / D. ودوتيرون المتبقية (4.5 ٪) في سلاسل جانب البيبسين هضمالببتيدات إد يجب أن يكون مطروح. الجزء الخلفي لتبادل هو خسارة حتمية لمعالجة بالديوتريوم في جميع الببتيدات deuterated وهضم الببسين في كتلة عملية القياس. ومعظم المذيبات الببتيد الوصول (م / ض = 1105.60) بعد ساعة من H - 24 / D تبادل يمثل معالجة بالديوتريوم المنطقة بالكامل. عدد دوتيرون أدرجت لكل من الببتيدات هو الفرق بين النقطه الوسطى من الببتيدات Pak2 deuterated الهضمية وغير deuterated. تم اختيار معظم الببتيد deuterated جدا م / ض 1105 لتمثيل معالجة بالديوتريوم كامل عندما كان في Pak2 24 ساعة من H / D الصرف. تم احتساب نسبة صرف عودة من العدد الفعلي دوتيرون أدرجت في 24 ساعة من H / D تبادل مقسوما على جميع المواقع المحتملة للصرف في الببتيد م / ض 1105.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> D 2 O </td><td> الدريتش </td><td> 7789-20-0 </td><td></td></tr><tr><td> α - cyano - 4 - hydroxycinnamic حمض </td><td> سيغما </td><td> 28166-41-8 </td><td></td></tr><tr><td> MALDI - TOF </td><td> PE النظم البيولوجية </td><td> يسترسل DE STR </td><td></td></tr><tr><td> Q - TOF مطياف الكتلة </td><td> Q - TOF ألتيما ، العالمي </td><td></td><td></td></tr><tr><td> QSTAR XL oMALDI MS / MS </td><td> تطبيق النظم البيولوجية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> بيانات الكمبيوتر إكسبلورر 4.0 البرنامج </td><td> تطبيق النظم البيولوجية </td><td></td><td></td></tص&gt; </tbody></table>

أميد الهيدروجينية / الديتريوم الطيف الكتلي تبادل و- tof maldi تحليل pak2 التنشيط

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

وقد أميد الهيدروجين / تبادل الديوتيريوم (H / تبادل D) مقرونا المستخدمة على نطاق واسع الطيف الكتلي لتحليل واجهة من البروتين البروتين التفاعلات والتغيرات متعلق بتكوين البروتين ، وديناميات البروتين وتفاعلات البروتين يجند. وقد استخدمت H / D على تبادل المناصب أميد العمود الفقري لقياس معدلات معالجة بالديوتريوم من المناطق الصغيرة في بروتين بواسطة الطيف الكتلي 1،2،3. حل هذا الأسلوب يعتمد على الهضم من البروتين البيبسين deuterated الفائدة في الببتيدات التي تتراوح عادة 3-20 المخلفات. على الرغم من أن القرار من H / D تبادل يقاس الطيف الكتلي هو أقل من واحد بقايا القرار تقاس Heteronuclear الكم طريقة واحدة (HSQC) تماسك الرنين المغناطيسي ، وقياس الطيف الكتلي في H / D الصرف ليس مقيدا حجم 4 البروتين. ويتم H / D الصرف في محلول مائي التي تحافظ على التشكل من البروتين. نحن نقدم طريقة التي UTILizes في MALDI - TOF للكشف 2 ، بدلا من نظام MS - HPLC / ESI (التأين electrospray) 5،6. و- TOF MALDI توفر بيانات دقيقة عن كثافة الشامل للالببتيدات من البروتين المهضوم ، في هذه الحالة بروتين كيناز Pak2 (وتسمى أيضا γ باك). ويتم التحلل البروتيني من باك 2 من أصل في هضم الببسين حاليا. هذه الطريقة البديلة ، وعندما يقوم المستخدم ليس الوصول إلى عمود HPLC والبيبسين متصلة مطياف الكتلة ، أو عندما يكون العمود البيبسين على HPLC لا ينتج مخطط الهضم الأمثل ، وعلى سبيل المثال ، بشدة ثاني كبريتيد العبودي يفرز فسفوليباز A 2 (الجيش الشعبي 2). باستخدام هذا الأسلوب ، ونحن بنجاح رصد التغيرات في مستوى معالجة بالديوتريوم خلال تفعيل Pak2 التي تشطر 3 caspase وautophosphorylation 7،8،9.

وقد استخدمت بنجاح MALDI - TOF الطيف الكتلي لرصد الهيدروجين أميد / الديوتيريوم الصرف في بروتين كيناز Pak2 التنشيط.

أميد الهيدروجينية / الديتريوم الطيف الكتلي تبادل و- TOF MALDI تحليل Pak2 التنشيط

لقد استُخدم تبادل الهيدروجين/الديوتيريوم في مجموعة الأميد (H/D exchange) المقترن بمطيافية الكتلة على نطاق واسع لتحليل الواجهة البينية للتآثر بين البروتين والبروتين...

توضح هذه التجربة كيفية استخدام مطيافية الكتلة لمراقبة تبادل الهيدروجين بالديوتيريوم المرتبط بالبروتين. تؤدي التغيرات الهيكلية إلى حالات التنشيط؛ حيث يتم أولاً شطر بروتين kinase PAC2 بواسطة caspase 3، ثم يتم تنشيط PAC2 عن طريق الفسفرة الذاتية باستخدام ATP كركيزة. وفي خطوة ثانية، يتم هضم PAC2 باستخدام Pepsin وتحليل شظايا بروتين PAC2 بواسطة مطيافية الكتلة الترادفية. بعد ذلك، يتم تحليل أنماط تبادل الهيدروجين بالديوتيريوم لـ PAC2 من خلال المراقبة المستمرة لمستوى كل شظية من PAC2، وتحديد المستوى الدقيق لتبادل الهيدروجين بالديوتيريوم باستخدام تحليل mold. توفر هذه العملية رؤى مهمة حول عملية شطر caspase 3 والفسفرة الذاتية لـ PAC2.يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على تساؤلات حول ديناميكيات البروتين، مثل التغيرات التشكيلية للبروتين، وتفاعلات البروتين مع الربيطات، والتفاعلات بين البروتينات. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل قياس الطيف الكتلي LCQ المعتمد على تبادل الهيدروجين والدوتيريوم (HD exchange)، في الجانب الأدواتي؛ حيث لا يتطلب هذا الإجراء وجود مطياف كتلة مرتبط بجهاز HPLC لتحليل نتائج تبادل HD، كما أن الإجراء سهل التشغيل لفصم 0.6 micrograms من PAC two.أضف caspase three واحضن التفاعل عند 34 °C لمدة 30 دقيقة. تحقق من PAC two والتحلل الكامل لـ PAC two عن طريق تحليل النواتج باستخدام SDS page. وبالنسبة لتفاعل التنشيط، أضف pack two المتحلل إلى 20 µL من منظم التنشيط (activation buffer B) واحضنه عند 34 °C لمدة 30 دقيقة.استخدم الفصل الكهربائي للهلام بـ SDS للتأكيد على الفسفرة الذاتية من خلال هجرة الشظايا P 34 وP 27. أولاً، اغسل حبيبات aro المقترنة بالبيورين مرتين باستخدام 1 mL من حمض Trifluoroacetic بتركيز 0.1%. خفف 2 µL من تركيز 10 mg/mL Pack 2 في 100 µL من TFA بتركيز 0.1%. أضف 30 µL من حبيبات agro المقترنة بالبيورين المغسولة واحضن الخليط لمدة خمس دقائق.باشر بمعادلة عمود H-P-L-C-C 18 ذو الطور المعكوس باستخدام 0.1%TFA عند pH 2.5. ثم قم بتحميل نواتج هضم Pepin وتخفيفها باستخدام تدرج خطي لمدة 100 دقيقة. اجمع الأجزاء كل دقيقتين بعد تجفيف أجزاء HPLC باستخدام SpeedVac.قم بتعليق العينات في 5 µL من أسيتونيتريل و0.1% TFA عند pH 2.5. كمسح أولي، قم بتحليل كل جزء للبحث عن الببتيدات باستخدام MALDI لجميع الأجزاء التي تحتوي على ببتيدات.حدد الشظايا باستخدام مطيافية الكتلة الترادفية. استخدم وظيفة MS product في برنامج protein prospector لمطابقة الأيونات الوليدة ونسب MZ النظرية بناءً على التسلسل الأساسي لـ PAC two. أولاً، قم بموازنة جميع المحاليل والكواشف لعملية تبادل الهيدروجين والديوتيريوم.ابدأ عملية تبادل الهيدروجين والديوتيريوم بإضافة 18 µL من المنظم D₂O إلى 2 µL من البروتين بتركيز 10 mg/mL. نفذ التفاعلات في ثلاث مكررات على مدار فترة زمنية محددة. أوقف تفاعل تبادل الهيدروجين والديوتيريوم بإضافة 180 µL من 0.1% TFA مبردة بالثلج عند pH 2.2.قم الآن بتوزيع حصص مقدارها 100 µL من الهيدروجين والديوتيريوم. أضف حصتين إلى كل 30 µL من حبيبات التجميع المقترنة بـ pepin المنشطة. قم بحضن عملية هضم pepin هذه على الثلج لمدة خمس دقائق.يؤدي الرج الميكانيكي (Vortexing) كل 30 ثانية إلى إنهاء تفاعلات الهضم بفعالية، ثم يتم إجراء الطرد المركزي لإزالة الـ Pepin بسرعة. تُجمد العينات في النيتروجين السائل حتى يتم تحليلها. قم بتحضير المصفوفة وتخزينها عند درجة حرارة 0 °C، ثم قم بإذابة كل عينة جزئيًا وبسرعة.امزج 1 µL من العينة مع 1 µL من القالب (matrix)، ثم ضع النقطة على لوحة هدف MALDI مبردة عند 4 °C قبل 30 ثانية من تحليل MALDI. طبق تفريغاً هوائياً متوسطاً على اللوحة للتجفيف. تستمر البقع في اكتساب أطياف كتلة MALDI بمتوسط 100 مسح خلال دقيقتين.انتقل إلى استخدام البرنامج الحاسوبي Data Explorer 4.0 لحساب مدة كل قطعة. ثم احسب التبادل العكسي بناءً على نسبة الدمج الفعلي الناتج عن عدد في 24 ساعة من تبادل الهيدروجين والدوتيريوم مقسومًا على جميع المواقع القابلة للتبادل، وهي أميدات الهيكل الأساسي، باستثناء الأميد الطرفي النهائي. في هذا المثال، يتم التحقق من انقسام CASP Bay والفسفرة الذاتية عن طريق صبغ Coomassie في تحليل SDS page.يظهر البروتين PAC2 غير الفسفوري غير النشط كحزمة واحدة بحجم 58 kilodaltons. ويكون انقسام PAC2 كاملاً وينتج عنه قطعتان، P27 وهي النطاق التنظيمي، وP34 وهي النطاق التحفيزي، وذلك بعد عملية الفسفرة الذاتية. ويظهر هجرة P27 وP34 المفسفرتين ذاتياً تداخلاً على هلام البروتين نتيجة تباطؤ هجرة قطعة P27 المفسفرة بالكامل مقارنة بـ PAC2 غير الفسفوري.يظهر طيف الكتلة هذا المسار الزمني لدمج الديوتيريوم لبروتين PAC two غير النشط. تتكون ذروة MZ 1697.85 من عدة ذروات نظيرية كما يتضح من إزاحة غلاف الكتلة. ومع مرور الوقت، يشير الخط الأحمر المنقط إلى متوسط غلاف الكتلة، وتوضح إزاحة غلاف الكتلة مدة استغراق الببتيد.يمكن إكمال هذه التقنية في غضون يومين إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. لا تنسَ أن العمل مع النيتروجين السائل يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا اتخذ الاحتياطات اللازمة مثل ثقب غطاء أنبوب EOL سعة 1.5 mil قبل وضعه في النيتروجين السائل.

amide-hydrogendeuterium-exchange-maldi-tof-mass-spectrometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يسين كيناز كرر ريتش 2 هو كيناز متعددة المجالات الكبيرة ، والطفرات التي هي السبب الأكثر شيوعا الجينية لمرض الشلل الرعاش. وقد أثبت تحليل للنشاط هذا البروتين كيناز ليكون أداة حاسمة في فهم البيولوجيا واختلال وظيفي في هذا البروتين. في هذه الورقة...

يعاير النشاط كيناز من LRRK2 في المختبر</em

التشكل البروتين وديناميات هي المفتاح لفهم العلاقة بين بنية البروتين ووظيفته. تبادل الهيدروجين مقرونا عالية الدقة قياس الطيف الكتلي هو طريقة تنوعا لدراسة ديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات وكذلك تميز البروتين يجند والبروتين البروتين التفاعلات، بما في ذلك واجهات الاتصال والآثار تفارغي.

تحليل ديناميات البروتين عن طريق صرف الهيدروجين الطيف الكتلي

نحن هنا وصف بروتوكول لتنقية وتوصيف المجمعات البروتين النباتي. علينا أن نظهر ذلك من خلال immunoprecipitating بروتين واحد ضمن مجمع، حتى نتمكن من تحديد التعديلات في مرحلة ما بعد متعدية والشركاء التفاعل فيها.

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

باستخدام ميكروأرس البروتين تحتوي على ما يقرب من S. كامل تم بحثها الخباز بروتيوم للاستجواب غير متحيز السريع الآلاف من تفاعلات البروتين البروتين بشكل متواز. هذه الطريقة يمكن استخدامها ل-بروتين صغير جزيء أو تعديل posttranslational، وفحوصات أخرى في الإنتاجية العالية.

التحقيق عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية لكشف البروتين البروتين التفاعلات

المرونة بتكوين تلعب دورا حاسما في وظيفة البروتين. هنا، نحن تصف استخدام تأين بالإرذاذ الإلكتروني مطياف الكتلة وقت حل جانب لصرف الهيدروجين الديوتيريوم للتحقق التغييرات الهيكلية السريعة التي تدفع وظيفة في البروتينات أمر والمختلين.

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

تتطور الكينازات البروتينية بشكل كبير الإنزيمات والسقالات التي هي حاسمة لانتشار إشارة بين الخلايا وداخل الخلايا. نقدم بروتوكول لقياس نشاط كيناز من خلال استخدام أدينوسين ثلاثي الفوسفات راديولبلد ([γ- 32 P] أتب)، وهي طريقة موثوق بها للمساعدة في توضيح تنظيم الإشارات الخلوية.

فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

يصف سير العمل هذا أداء الإثراء الفعال للوقت والتكلفة للتعديلات المتعددة للبروتين بعد الترجمة (PTMs) في وقت واحد للتحليل الكمي العالمي للبروتيوميات. يستخدم البروتوكول تخصيب PTM على مستوى الببتيد مع أجسام مضادة مترافقة متعددة ، يليه تحليل قياس الطيف الكتلي للاستحواذ المستقل عن البيانات للحصول على رؤى بيولوجية في الكلام المتبادل PTM.

إثراء التقارب المتزامن لتعديلات ما بعد الترجمة للقياس الكمي وتوطين الموقع

Lanthipeptide synthetases يحفز ردود الفعل متعددة الخطوات خلال التمثيل الحيوي للمنتجات الطبيعية الببتيد. هنا، ونحن نصف مستمر، من أسفل إلى أعلى، الهيدروجين الديوتريوم تبادل الطيف الكتل (HDX-MS) سير العمل التي يمكن استخدامها لدراسة الديناميات التركيبية من synthetases lanthipeptide، فضلا عن الإنزيمات المماثلة الأخرى المشاركة في التمثيل الحيوي للمنتج الطبيعي الببتيد.

منصة قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) للتحقيق في إنزيمات الببتيد التركيب الحيوي

الجمع بين وضع العلامات النظائرية السلائف وseobaric وضع العلامات (cPILOT) هو نموذج معزز استراتيجية تعدد قادرة على زيادة عدد العينات التي يمكن تحليلها في وقت واحد مع العلامات isobaric المتاحة. وقد أدى دمج منصة الروبوتية إلى زيادة كبيرة في الإنتاجية التجريبية، وقابلية التكاثر، والدقة الكمية.

التلقائية عينة تعدد المكونات المتعددة باستخدام الجمع بين السلائف النظائر وسمات Isobaric (cPILOT)

إن القدرة على تقييم المشاركة المستهدفة من قبل مثبطات المرشح في الخلايا السليمة أمر بالغ الأهمية لاكتشاف المخدرات. يصف هذا البروتوكول 384 شكل جيد فحص التحول الحراري الخلوي الذي يكشف بشكل موثوق الاشتباك الهدف الخلوي من مثبطات تستهدف إما البرية من نوع SHP2 أو المتغيرات oncogenic لها.

تقييم المشاركة المستهدفة الخلوية من قبل SHP2 (PTPN11) مثبطات Phosphatase

هنا ، نقدم بروتوكولا لإثراء فوسفاتيز البروتين الفوسفوبروتين الداخلي المنشأ وبروتيناتها المتفاعلة من الخلايا والأنسجة وتحديدها وتحديدها كميا بواسطة البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي.

نهج قائم على قياس الطيف الكتلي لتحديد فوسفاتيز فوسفوبروتين وتفاعلاتها

اكتشف كيفية استخدام طيف الكتلة MALDI-TOF لمراقبة تبادل الهيدروجين/الديوتيريوم أثناء تنشيط بروتين كيناز Pak2. توفر هذه الطريقة رؤى قيمة حول ديناميكيات البروتين وتغيرات التركيب ثلاثي الأبعاد.

أميد الهيدروجينية / الديتريوم الطيف الكتلي تبادل و- TOF MALDI تحليل Pak2 التنشيط

استكشف المزيد من الفيديوهات