تحليل للهجرة كريست العصبية والتمايز بواسطة الصليب الأنواع زرع

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطعيم قطعة مستأصلة من الأنبوب العصبي الظهري من جنين سمان في جنين دجاج مطابق له في المرحلة العمرية، وذلك لتتبع هجرة ومصير خلايا العرف العصبي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إحداث ثقب صغير في غشاء IGN لجنين الدجاج المضيف للوصول إلى الأنبوب العصبي. بعد ذلك، يتم إخراج جنين السمان المانح من بيضته لتحضيره لعملية استئصال الطعم.

في الخطوة التالية، يتم استئصال المنطقة ذات الاهتمام من الأنبوب العصبي للجنين المضيف. ثم يتم استئصال منطقة مماثلة من الأنبوب العصبي للمانح لغرض التطعيم. بعد ذلك، يتم نقل الأنبوب العصبي المانح وزراعته في الأنبوب العصبي للمضيف.

أخيرًا، يتم تحضين الجنين الخيمري حتى المرحلة المطلوبة للكشف عن وصول خلايا العرف العصبي إلى العضو المختار. وفي نهاية المطاف، يمكن تصور هجرة وتمايز خلايا العرف العصبي المشتقة من المانح في مواقع مختلفة من جنين المضيف من خلال مجهر الفلورة المناعية. ويُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرًا بالغ الأهمية لأن خطوات التشريح الدقيق والترقيع تتطلب مهارات حركية دقيقة جدًا، مما يجعل تعلمها صعبًا.

ابدأ بغسل أي شوائب من بيض الكتاكيت باستخدام ماء فاتر. رتب البيض أفقياً على صينية، ثم ضع علامة بالقلم الرصاص على الجوانب المتجهة للأعلى لتحديد المنطقة التي سيتمركز فيها الجنين. لتحضير أجنة المانح بطريقة X ovo، قم بحضن أرجل السمان في الجانب غير المدبب.

في الخطوة التالية، ضع البيض في حاضنة مرطبة عند درجة حرارة 38 degrees Celsius وقم بتفعيل خاصية التأرجح. بعد انتهاء فترة احتضان البيض، قم بتعقيم الأجزاء العلوية عن طريق رشها بـ 70%ethanol ثم مسحها بسرعة باستخدام منديل kim wipe. ولتجنب أي امتصاص عبر قشرة البيضة، ضع كل بيضة معقمة على حامل بيض منفصل، على غرار طبق Petri dish المبطن بمناديل Kim wipes مطوية كما هو موضح هنا. بعد ذلك، وباستخدام ملقط AA معقم، اصنع ثقباً صغيراً في السطح العلوي لقشرة البيضة عند الطرف المدبب للبيضة.

جهز محقنة سعة 5 mL بإبرة تحت جلدية قياس 18.5 gauge. بعد ذلك، قم بإدخال الإبرة عمودياً في الفتحة الموجودة في قشرة البيضة مع توجيه الشطبة نحو الطرف المدبب للبيضة. ولتجنب إتلاف المح، عن طريق السحب العرضي، قم بتنظيف الفتحة بـ 70% ethanol كما سبق، ثم أغلق الفتحة باستخدام شريط لاصق.

بعد ذلك، وباستخدام ملقط double A، قم بعمل ثقب آخر في السطح العلوي المحدد للساق الأفقية، بحيث لا يكون عند القمة تماماً. بعد ذلك، أدخل أحد طرفي ملقط iris المنحني في الثقب بشكل موازٍ للبيضة. ثم قم بالضغط على القشرة مع التحريك في حركة دائرية.

قم بعمل فتحة في قشرة بيضة الدجاج بقطر 2 cm، وتخلص من جزء القشرة المزال. يجب أن يظهر الجنين على شكل قرص معتم فوق الصفار. تخلص من أي بيوض غير ملقحة يتم التعرف عليها من خلال وجود بقعة بيضاء صغيرة على سطح الصفار أو غياب القرص الجرثومي (blastoderm).

الآن، وأثناء ارتداء واقي العين المناسب، قم بثني إبرة تحت الجلد قياس 26.5 بمقدار 45 درجة بدءاً من قاعدة الإبرة. بعد تركيب الإبرة المثنية على محقنة سعة 1 مل بحيث يكون الجانب المائل للأعلى، املأ الإبرة بحبر الهند المخفف. قم بثقب غشاء المح، خارج محيط منطقة التفجير (blaster)، ثم مرر طرف الإبرة أسفل الجنين، بالقرب من سطح المح، ولكن دون الدخول في الطبقات الجنينية.

ثم احقن كمية كافية فقط من الحبر لتحديد محيط الجنين مع تجنب حقن أي فقاعات. اسحب الإبرة بعناية. الآن استخدم مجهراً ستيريو ومصدراً ضوئياً ذا حمل حراري محدود، مثل مصباح الألياف الضوئية ذو العنق المرن الموضح هنا.

قم بتحديد مرحلة نمو الأجنة وفقاً لتصنيف هامبورغر وهاملتون. سجل المرحلة على قشور البيض. ثم ضع قطرتين إلى ثلاث قطرات من محلول رينجر المعقم والدافئ على سطح الأجنة لمنع الجفاف والتلوث.

بعد ذلك، قم بتغطية سطح البيض بغشاء البارافيلم (para film) لسد النوافذ مؤقتاً. تالياً، قم بتجهيز بيض السمان لعملية النقل. وقبل إخراج البيض من الحاضنة، املأ طبق بتري بمحلول رينجر (ringer solution).

بعد ذلك، افتح البيض من الجانب غير المدبب باستخدام ملقط منحني للكشف عن الجنين. وباستخدام مقص التشريح، قم بإجراء أربعة شقوق على شكل مربع عبر الغشاء الزغبي والقرص الجرثومي خارج الجنين، مع التأكد من التقاء جميع الشقوق. ثم باستخدام ملقط قزحية منحني، أمسك برفق بإحدى الحواف المقطوعة وارفع الجنين من البيضة وانقله إلى أطباق بتري المجهزة.

أخيرًا، قم بإزالة الغشاء المحي وهو بلطف باستخدام ملقط رقم خمسة، ثم قم بتحديد مرحلة الأجنة تحت مجهر تشريحي. أزل شريط البارافيلم من جنين الدجاج المضيف. بعد ذلك، وباستخدام إبرة تنجستن مدببة، اصنع ثقباً صغيراً في الغشاء المحي عند المنطقة المطلوبة من الأنبوب العصبي.

أضف قطرة من محلول رينجر إلى الجنين. بعد ذلك، بالنسبة للطعوم أحادية الجانب، كما هو موضح في هذا الفيديو، استخدم إبرة زجاجية مسحوبة لإجراء شقوق مستعرضة من الجهتين الرأسية والذيلية بعناية في منطقة الدماغ المتوسط للأنبوب العصبي، مع مراعاة عدم تجاوز التجويف. ثم قم بالقص من الجانبين بين الأنبوب العصبي الظهري والميزوديرم الجداري.

أخيرًا، افصل بدقة الجزء المستأصل من الشرح (explan) عن الأنبوب العصبي، ثم قم بإزالته من الجنين عن طريق شفطه داخل ماصة زجاجية دقيقة. أولاً، استخدم جنيناً لسمانة (quail) في مرحلة نمو مطابقة. ثم استأصل منطقة من الأنبوب العصبي بحجم مماثل لما تم عرضه للتو، واشفط الشرح (explan) المانح داخل ماصة زجاجية دقيقة تحتوي على محلول رينجر (ringers solution).

انقل قطعة النسيج X إلى المنطقة المجاورة للمنطقة المستأصلة من المضيف (الكتكوت). ثم باستخدام إبرة زجاجية مسحوبة، قم بتوجيه قطعة النسيج برفق وإدخالها في المنطقة المزالة. أضف بعناية بضع قطرات من محلول رينجر إلى الجنين لمنع الجفاف.

أخيراً، قم بإغلاق النافذة باستخدام شريط لاصق، مع التأكد من أن الشريط يغلق منطقة النافذة في البيضة بالكامل، ثم أعد البيضة إلى الحاضنة حتى الوصول إلى المرحلة المطلوبة، مع إيقاف تشغيل وظيفة التأرجح أثناء تحضين الأجنة، ويمكن تدوير البيض يدوياً بلطف مرتين يومياً لزيادة فرص بقائها على قيد الحياة. في حال استهداف مراحل متأخرة من النمو، تظهر هذه الصورة التمثيلية للمنطقة المطعمة من الأنبوب العصبي بعد ست ساعات من إعادة التحضين حتى المرحلة HH 11، الاندماج المتوقع لأنسجة المانح من السمان المطعمة داخل الأنبوب العصبي للجنين المضيف من الدجاج. ويظهر هذا المقطع العرضي عبر المنطقة المطعمة في المرحلة HH 11 خلايا العرف العصبي المحددة بـ hnk، حيث تهاجر إحداها جانبياً بعيداً عن الأنبوب العصبي.

تظهر خلايا السمان التي تساهم في تيار هجرة خلايا العرف العصبي وفي الأنبوب العصبي مميزة بوضوح باستخدام QCPN. وفي مراحل لاحقة، يمكن تتبع الخلايا المشتقة من خلايا العرف العصبي للسمان وصولاً إلى أنسجتها المستهدفة النهائية. وكما يتضح في هذا الشكل، تتوزع الخلايا المميزة بـ QCPN داخل النتوء الفكي للجنين الدجاج. وفي المرحلة E5، يمكن دمج جسم المضاد QCPN بسهولة مع أجسام مضادة أخرى لفحص تمايز خلايا العرف العصبي المشتقة من السمان.

في البيئة المضيفة. كما يظهر هنا، تم وسم العصبونات الحسية ثلاثية التوائم المشتقة من خلايا العرف العصبي للسمان باستخدام أجسام مضادة من نوع QCPN و T UJ one. عقب هذا الإجراء، يمكن تطبيق طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية والتهجين الموضعي للإجابة على أسئلة إضافية، مثل الأنسجة التي تنشأ عن خلايا العرف العصبي، والجينات التي تعبر عنها هذه الخلايا أثناء تمايزها إلى أنسجة مختلفة.