الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد العيارات الفيروسية للأنفلونزا في الشعب الهوائية للفئران المصابة بكفاءة. يتم تلقيح الفئران لأول مرة عن طريق الأنف بفيروس الأنفلونزا في وقت محدد. نقاط بعد الإصابة.

يتم التضحية ب M وجمع غسل القصبات الهوائية أو سائل BAL. بعد ذلك ، يتم استخدام سائل BAL لإصابة خلايا MDCK. يمكن بعد ذلك تلطيخ الخلايا المصابة لوجود بروتينات فيروسية باستخدام أجسام مضادة أولية محددة ، تليها أجسام مضادة ثانوية مترافقة بالأشعة تحت الحمراء.

تتم قراءة إشارات الأشعة تحت الحمراء باستخدام الماسح الضوئي Lycor Odyssey ويمكن استخدام برنامج Odyssey لتحديد العيار الفيروسي. باستخدام منحنى قياسي ، يمكن الحصول على التحديد الكمي للعيار الفيروسي. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية في القياس الكمي الدقيق للعيار الفيروسي ، وقابلية التكاثر ، والحجم الصغير المطلوب لإجراء هذا الفحص.

يمكن توسيع الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص وعلاج الأمراض الفيروسية التنفسية المختلفة لأنه يمكن استخدامها لتحديد العيار الفيروسي في العينات السريرية بعد هذا الإجراء. يمكن تنفيذ طريقة أخرى مثل QPCR من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل رقم النسخة الفيروسية. أثناء محاولة هذه التقنية ، من المهم أن تتذكر التحقق من فيروس التحكم القياسي بعد هذا التطور.

تمهد هذه التقنية الطريق للباحث في مجال المنطق الفيروسي لاستكشاف عيار الفيروس أو لف البروتين الفيروسي في العينات السريرية. بمجرد إتقان هذه التقنية يمكن إجراؤها في 17 ساعة. كان أداء على وجه التحديد إصابة الفئران داخل الأنف مع 5 ، 000 وحدات منصة أو PFU من PR ثمانية فيروس إنفلونزا في 30 ميكرولتر من PBS المعقمة أو مع PBS وحدها كتحكم سلبي لجمع سائل BAL من القتل الرحيم أولا ، وقطع أن التجويف الصدري مفتوح وعمل شق سنتيمتر واحد مواز للقصبة الهوائية لفضحه بمقص معقم ناعم.

قم بعمل شق صغير في القصبة الهوائية ، وقم بغرس القصبة الهوائية ب 0.5 مل من 1٪ BSA الذي يحتوي على PBS وشفط سائل الغسيل برفق. قم بتخزين سوائل BAL عند سالب 20 درجة مئوية لتحديد العيارات الفيروسية في سوائل الغسيل. أول زراعة 5 ملايين خلية MDCK في 20 مل من RPMI الكامل في قارورة T 75 بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي ، وحصاد الخلايا ووضعها في صفيحة بئر سوداء مسطحة بصرية 96 عند 10 ، 000 خلية لكل بئر.

ثم احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية بعد الحضانة. شفط المادة الطافية برفق وغسل الخلايا مرتين في DMEM كامل ولكن خال من المصل يحتوي على 0.2٪ BSA بدلا من FBS. بمجرد غسل الخلايا ، أضف 50 ميكرولترا من سائل BAL أو 50 ميكرولترا من المعلق الذي يحتوي على تركيز معروف من الفيروس لكل بئر.

ثم أضف 50 ميكرولترا لكل بئر من DMEM ، وهو وسط يحتوي على التربسين المعالج TPCK بمعدل 0.2 ميكروغرام لكل مليلتر لتعزيز الارتباط الفيروسي ودخوله وتكاثره. احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية للسماح للفيروس بالامتصاص. ثم أضف 100 ميكرولتر من FBS تحتوي على RPMI كامل إلى كل بئر ، وزرع الخلايا طوال الليل للسماح للعدوى بالانتشار بعد الحضانة الليلية.

اغسل الخلايا ب 100 ميكرولتر من 1٪ B-S-A-P-B-S. بمجرد غسل الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر لكل بئر 1٪ بارا فورمالديهايد واحتضان الألواح لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لإصلاح الخلايا بعد ذلك ، اغسل ب 100 ميكرولتر لكل بئر 1٪ B-S-A-P-B-S واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة أخرى للحظر. بمجرد حظر الخلايا ، أضف 50 ميكرولترا لكل بئر من الجسم المضاد المضاد للفيروسات M الأولي المخفف عند واحد إلى 1000 ، واحتضن الألواح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتلطيخ أي بروتين فيروسي موجود بعد الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات في 1٪ B-S-A-P-B-S واحتضانها ب 100 ميكرولتر لكل بئر من الجسم المضاد الثانوي المترافق بصبغة الأشعة تحت الحمراء عند تخفيف من واحد إلى 200 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام بمجرد تلطيخ الخلايا ، اغسلها ثلاث مرات كما كان من قبل.

ثم ضع اللوحات على منصة زجاج القراءة للماسح الضوئي بالأشعة تحت الحمراء Licor Odyssey. حدد إعداد لوحة البئر 96 على القارئ باستخدام برنامج Licor Odyssey. حدد آبار التحكم السلبية الفارغة ، ثم حدد كمية التألق من اللوحة بأكملها.

استخدم أداة التشكيل التلقائي لرسم منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار في منتصف الاختبار. حسنا ، استخدم عائد الاستثمار من عنصر تحكم سلبي. حسنا ، لتعيين قيمة التألق الأساسي للمقايسة ، ثم أدخل الشعيرات المتقاطعة المتعارضة التي يوفرها برنامج Odyssey ضمن عائد الاستثمار لقياس شدة التألق عبر البئر.

بعد ذلك ، قم بمسح اللوحة باستخدام قناة 780 نانومتر للكشف و 680 نانومتر كطول موجي مرجعي. بمجرد تنشيط أمر القراءة ، سيتم قياس شدة الفلورسنت على فترات موحدة من عائد الاستثمار. ثم تم دمج نقاط البيانات التي تم جمعها.

سيحدد مضاعف الانحراف المعياري مستوى الإشارة عبر خط الأساس المضمن في عائد الاستثمار ، تأكد من تحديد خيار الكثافة المتكامل للحسابات لأنه يمثل صافي حجم البكسل للمناطق المحددة بشكل مستقل عن الحجم. سيتم قياس مضان الخلفية من الضوابط المصابة الوهمية وسيتم استخدامه لتقدير الكثافة المتكاملة في آبار الاختبار. يتم استخدام التألق بالأشعة تحت الحمراء من الآبار المكررة التي تحتوي على تخفيفات تسلسلية للفيروس المعاير لبناء منحنى قياسي.

يمكن بعد ذلك استخدام المنحنى القياسي لتحديد عيار سائل BAL من الفئران المصابة. في هذه التجربة ، لوحظت زيادة كبيرة في الحمل الفيروسي في اليومين الثاني والرابع. تم إزالة فيروس ما بعد الإصابة بحلول اليوم 10 كما هو موضح هنا.

ترتبط العيارات الفيروسية المقاسة باستخدام هذا الاختبار ارتباطا جيدا بفقدان وزن الفأر بعد الإصابة. يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على العينات البشرية. يظهر هنا تقدير كمي لفيروس H one N واحد من مسحة أنف بشرية.

حد الكشف هنا هو 10 إلى الجرعة الثالثة من TCID أو ثقافة الأنسجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، لديك أيضا فهم جيد لكيفية تقدير عيار فيروس الأنفلونزا باستخدام الفحص القائم على الأشعة تحت الحمراء. يعد العرض المرئي لهذه التقنية أمرا بالغ الأهمية لأن استخدام جهاز تصوير corp قد يكون صعبا وسيساعد ذلك في تبسيط وإظهار أساليبنا لقياس العيار الفيروسي في لوحة بئر 96 أو 384.

وأخيرا ، لا تنس أن العمل مع الفيروس يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما أخذ السلائف مثل معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.