الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

الهدف العام من هذا الإجراء هو التقدير الكمي الفعال لعيارات الفيروسات الإنفلونزا في المجاري التنفسية للفئران المصابة. يتم أولاً تلقيح الفئران عبر الأنف بفيروس الإنفلونزا في نقاط زمنية مختارة بعد الإصابة.

يتم التضحية بـ M وجمع سائل الغسيل القصبي السنخي أو سائل BAL. بعد ذلك، يُستخدم سائل BAL لإصابة خلايا MDCK. ويمكن بعد ذلك صبغ الخلايا المصابة للكشف عن وجود البروتينات الفيروسية باستخدام أجسام مضادة أولية محددة، تليها أجسام مضادة ثانوية مقترنة بالأشعة تحت الحمراء.

تُقرأ الإشارات بالأشعة تحت الحمراء باستخدام ماسح Lycor Odyssey، ويمكن استخدام برنامج Odyssey لتحديد عيارات الفيروسات. ومن خلال استخدام منحنى قياسي، يمكن الحصول على تقدير كمي لعيارات الفيروسات. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في التحديد الكمي الدقيق لعيارات الفيروسات، وقابلية تكرار النتائج، والحجم الضئيل المطلوب لإجراء هذا المقايسة.

يمكن توسيع تطبيقات هذه التقنية لتشمل تشخيص وعلاج مختلف الأمراض الفيروسية التنفسية، حيث يمكن استخدامها لتقدير العيارات الفيروسية في العينات السريرية بعد اتباع هذا الإجراء. كما يمكن إجراء طرق أخرى مثل QPCR للإجابة على تساؤلات إضافية، مثل عدد النسخ الفيروسية. وعند تطبيق هذه التقنية، من المهم تذكر فحص الفيروس المرجعي لمعايرة العيار بعد هذه المرحلة من التطوير.

تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الفيروسات لاستكشاف عيار الفيروس أو صبغ البروتين الفيروسي في العينات السريرية. وبمجرد إتقانها، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون 17 ساعة. يتم التنفيذ بدقة عن طريق حقن الفئران عن طريق الأنف بـ 5,000 وحدة تشكيل لوحية أو PFU من فيروس الإنفلونزا PR eight في 30 µL من محلول PBS المعقم، أو باستخدام PBS وحده كعينة ضابطة سلبية. ولجمع سائل غسيل القصبات والأسناخ (BAL) من الحيوانات التي تم قتلها رحيمًا، يتم أولاً فتح التجويف الصدري وإجراء شق بطول 1 cm موازٍ للرغامى لكشفها باستخدام مقص معقم ودقيق.

قم بإجراء شق صغير في القصبة الهوائية، ثم احقن القصبة الهوائية بـ 0.5 milliliters من 1%BSA المحتوي على PBS وقم بشفط سائل الغسيل برفق. احفظ سوائل BAL في درجة حرارة negative 20 degrees centigrade لتقدير العيارات الفيروسية في سوائل الغسيل. أولاً، قم باستنبات 5 million من خلايا MDCK في 20 milliliters من وسط RPMI الكامل في قارورة T 75 طوال الليل عند 37 degrees centigrade، وفي اليوم التالي، قم بحصد الخلايا وزراعتها في طبق 96 well أسود مسطح القاع مخصص للقياس الضوئي بكثافة 10,000 cells لكل بئر.

بعد ذلك، تُحضن الصفيحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية عقب عملية التحضين. يُشفط السائل الطافي برفق، وتُغسل الخلايا مرتين في وسط DMEM كامل ولكن خالٍ من المصل، بحيث يحتوي على 0.2%BSA بدلاً من FBS. وبمجرد غسل الخلايا، يُضاف 50 µL من سائل BAL أو 50 µL من معلق يحتوي على تركيز معلوم من الفيروس في كل بئر.

ثم أضف 50 µL لكل بئر من وسط DMEM، وهو وسط يحتوي على التربسين المعالج بـ TPCK بتركيز 0.2 µg/mL لتعزيز التصاق الفيروس ودخوله وتكاثره. قم بتحضين الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 °C للسماح للفيروس بالامتصاص. بعد ذلك، أضف 100 µL من وسط RPMI الكامل المحتوي على FBS إلى كل بئر، واستزرع الخلايا طوال الليل للسماح بانتشار العدوى بعد التحضين الليلي.

اغسل الخلايا باستخدام 100 µL من 1%B-S-A-P-B-S. وبمجرد غسل الخلايا، أضف 100 µL لكل بئر من 1%para formaldehyde واحضن الأطباق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الخلايا. بعد ذلك، اغسل الخلايا بـ 100 µL لكل بئر من 1%B-S-A-P-B-S واحضن الخلايا لمدة 30 دقيقة إضافية لعملية الحجب (blocking). وبمجرد حجب الخلايا، أضف 50 µL لكل بئر من الأجسام المضادة الأولية M two المضادة للفيروسات والمخففة بنسبة 1:1000، واحضن الأطباق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لصبغ أي بروتين فيروسي موجود. وبعد فترة الحضن، اغسل الخلايا ثلاث مرات في 1%B-S-A-P-B-S واحضنها مع 100 µL لكل بئر من الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بصبغة الأشعة تحت الحمراء بتخفيف 1:200 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. وبمجرد صبغ الخلايا، اغسلها ثلاث مرات كما سبق.

بعد ذلك، ضع الأطباق على منصة الزجاج القارئة في ماسح Licor Odyssey بالأشعة تحت الحمراء. اختر إعداد الطبق ذي 96 بئراً في القارئ باستخدام برنامج Licor Odyssey. حدد آبار التحكم السلبي الفارغة، ثم قم بقياس الفلورة من الطبق بالكامل.

استخدم أداة الأشكال التلقائية لرسم المنطقة المحددة للاهتمام أو ROI في منتصف بئر الاختبار. استخدم الـ ROI من بئر تحكم سلبي لتعيين قيمة الفلورة المرجعية للمقايسة، ثم أدخل خطوط التقاطع المتقابلة المقدمة من برنامج Odyssey داخل الـ ROI لقياس شدة الفلورة عبر البئر.

بعد ذلك، قم بعمل مسح للصفيحة باستخدام قناة 780 nanometer للكشف و 680 nanometer كطول موجي مرجعي. وبمجرد تفعيل أمر القراءة، سيتم قياس شدة الفلورة على فترات منتظمة ضمن منطقة الاهتمام (ROI)، ثم يتم دمج نقاط البيانات التي تم جمعها.

سيحدد مضاعف الانحراف المعياري مستوى الإشارة فوق الخط القاعدي التي سيتم تضمينها في منطقة الاهتمام (ROI)؛ تأكد من اختيار خيار الشدة المتكاملة (integrated intensity) لإجراء الحسابات لأنها تمثل صافي حجم البكسل للمناطق المحددة بغض النظر عن الحجم. سيتم قياس تألق الخلفية كمياً من ضوابط المحاكاة للعدوى، وستُستخدم لتقدير الشدة المتكاملة في آبار الاختبار. وتُستخدم الفلورة بالأشعة تحت الحمراء من الآبار المكررة التي تحتوي على تخفيفات تسلسلية للفيروس الملقح لبناء منحنى قياسي.

يمكن بعد ذلك استخدام المنحنى القياسي لتحديد عيارات سائل غسيل القصبات والأسناخ (BAL) من الفئران المصابة. في هذه التجربة، لوحظت زيادة كبيرة في الحمل الفيروسي في اليومين الثاني والرابع. وقد تم التخلص من الفيروس بعد العدوى بحلول اليوم 10 كما هو موضح هنا.

ترتبط عيارات الفيروس المقاسة باستخدام هذا المقايسة ارتباطاً وثيقاً بفقدان وزن الفئران بعد العدوى. كما يمكن تطبيق هذه التقنية على العينات البشرية. يظهر هنا تقدير كمي لفيروس H1N1 من مسحة أنفية بشرية.

حد الكشف هنا هو 10³ TCID أو الجرعة المعدية للمزارع النسيجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك أيضًا فهم جيد لكيفية تقدير عيار فيروس الإنفلونزا باستخدام المقايسة القائمة على الصبغة بالأشعة تحت الحمراء. يعد العرض المرئي لهذه التقنية أمرًا بالغ الأهمية لأن استخدام جهاز التصوير Core يمكن أن يكون صعبًا، وسوف يساعد هذا في تبسيط وتوضيح طرقنا لتقدير عيارات الفيروسات في لوحة ذات 96 أو 384 بئرًا.

وأخيراً، لا تنسَ أن العمل مع الفيروسات يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل استخدام معدات الوقاية الشخصية عند تنفيذ هذا الإجراء.