نماذج مامي لتصوير الخلايا الحية 4D من ورم: التفاعلات المكروية أن التقدم تأثير الخبيثة

الهدف العام من هذا الإجراء هو بناء نماذج زراعة مشتركة ثلاثية الأبعاد تسمى هندسة بنية وبيئة الثدي الدقيقة، أو MAM، لاستخدامها في تصوير الخلايا الحية للتفاعلات الخلوية في الوقت الفعلي. ويتم تحقيق ذلك من خلال طلاء الشرائح الغطائية أولاً بكولاجين النوع الأول المطفأ بصبغة D-quenched، أو DQ collagen one، وهو عبارة عن مصفوفة من كولاجين النوع الأول.

بعد ذلك، يتم إخماد الكولاجين من النوع الأول (DQ collagen one). رابعاً، تُضاف مصفوفة الغشاء القاعدي المعاد تكوينها فوق مصفوفة DQ collagen one المتصلبة، وهي مصفوفة كولاجين من النوع الأول تحتوي على خلايا ليفية مدمجة. وفي الخطوة الثالثة، يتم وضع طبقة من معلق الخلايا الظهارية أو الخلايا الورمية فوق شرائح التغطية، مما يسمح للخلايا بالالتصاق بـ DQ collagen one ومصفوفة الغشاء القاعدي المعاد تكوينها، ثم يُضاف الوسط الزرعي.

وأخيراً، يُستخدم المجهر البؤري (confocal microscopy) لإجراء تصوير رباعي الأبعاد (4D imaging)، والذي يحلل الصورة في ثلاثة أبعاد مكانية، بالإضافة إلى عامل الزمن للمستنبتات المشتركة الحية من خلايا الثدي. وفي نهاية المطاف، يتيح التصوير رباعي الأبعاد تصور وتحليل التفاعل الديناميكي بين خلايا ورم الثدي والخلايا الأخرى في البيئة المجهرية للورم التي قد تؤثر على التقدم نحو نمط ظاهري غزوي. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التصوير الحي داخل الجسم (intra vital imaging)، في أن التفاعلات المرصودة في نموذجنا تكون بين خلايا من نوع واحد، وهي خلايا الورم البشرية والخلايا البشرية المرتبطة بالورم، بدلاً من أن تكون، على سبيل المثال، بين خلايا الورم البشرية والخلايا السدوية للفئران.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن تجميع المزارع الأساسية الرئيسية يحتاج أولاً إلى تصور بصري، ثم يتطلب مهارات متوسطة وممارسة لتحقيق النجاح. ابدأ بوضع غطاء بلاستيكي مستطيل معقم بالكحول. قم بإدخاله في طبق زراعة قطر 35 مليمتر أو استخدم طبق mu من IBI tree بقطر 35 مليمتر.

بعد ذلك، اخلط العدد المطلوب من الخلايا الليفية مع كولاجين DQ. ثم، وباستخدام ماصة دقيقة سعة 100 ميكرولتر، اسحب بعناية ووزع 70 ميكرولتر من مزيج الخلايا الليفية وكولاجين DQ (مصفوفة كولاجين واحدة) على كامل سطح الشريحة الغطائية، وضع طبق الزراعة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. بعد أن تتصلب المصفوفات، اتركها لتتوازن لمدة 10 دقائق في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون.

بعد ذلك، ضع الطبق تحت غطاء سحب الهواء حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 60 µL من DQ collagen، وهو عبارة عن مصفوفة غشاء قاعدي مُعاد تشكيلها أربع مرات فوق DQ collagen المتصلب، ثم أضف collagen one matrix تحتوي على أرومات ليفية مدمجة. بعد ذلك، وباستخدام طرف الماصة، قم بتوزيع DQ collagen (مصفوفة الغشاء القاعدي المُعاد تشكيلها أربع مرات) بعناية وبشكل متساوٍ، مع تجنب خدش أرومات ليفية DQ collagen one (مصفوفة collagen one).

ثم انقل الطبق والغطاء الزجاجي إلى حضانة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% carbon dioxide لمدة 10 دقائق، وأثناء تجميد مصفوفة الغشاء القاعدي المعاد تشكيلها DQ collagen four، قم بهضم الخلايا باستخدام trypsin وعُد الخلايا من أجل المزرعة المشتركة. الآن، ضع 50 µL من معلق الخلايا على الغطاء الزجاجي المطلي، وضع الطبق في حضانة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% carbon dioxide لمدة 40 إلى 60 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق بـ DQ collagen four، مصفوفة الغشاء القاعدي المعاد تشكيلها. بعد التصاق الخلايا بالمصفوفة، أضف 2 mL من وسط المزرعة الذي يحتوي على 2% من الغشاء القاعدي المعاد تشكيله إلى الطبق الذي قطره 35 mm.

بعد ذلك، قم بالتحضين للفترة الزمنية المطلوبة قبل التصوير؛ فبعد الغسل باستخدام PBS، يتم تحضين المزارع المشتركة مع 5 µM من cell tracker orange في وسط MEGM داخل حاضنة عند درجة حرارة 37 °C و 5% carbon dioxide لمدة 45 دقيقة. وبعد انتهاء التحضين، اغسل المزارع المشتركة بـ PBS مرة أخرى ثم حضنها في وسط MEGM مُدفأ مسبقاً لمدة 30 دقيقة في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C و 5% carbon dioxide. صوّر المزارع المشتركة الحية بتكبير منخفض، على سبيل المثال، بتكبير 10x باستخدام عدسة غمر مائية في مجهر بؤري (confocal microscope)، مع التقاط مقاطع بصرية بفواصل زمنية قدرها 10 micron عبر كامل عمق التراكيب.

استخدم المقاطع البصرية لإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد (3D) باستخدام برنامج velocity أو برنامج مشابه. قم بإنشاء مقاطع فيديو لإعادة البناء ثلاثية الأبعاد بحيث يمكن تصور البنى، والتفاعلات بين الخلايا، والتفاعلات مع المصفوفة المحيطة. في هذا المخطط التوضيحي التمثيلي لمزرعة مشتركة، تم أولاً طلاء طبق IBI treat بـ collagen، وأحدهما يحتوي على DQ collagen، والآخر على fibroblasts كما هو موضح هنا باللون الأرجواني.

ثم أضيفت طبقة ثانية من الغشاء القاعدي المعاد تشكيله الذي يحتوي على DQ collagen four. بعد ذلك، تم زرع الخلايا الورمية باللون الأحمر في الأعلى فوق 2% من الغشاء القاعدي المعاد تشكيله في المزرعة.

تم تمثيل الوسط، الموضح بالنقاط ذات اللون الكريمي، من خلال وضعه فوق كل تغيير للوسط. وتظهر نواتج الانقسام الفلورية لـ DQ collagen one و DQ collagen four باللون الأخضر. وعلى مدار 23 يومًا من هذا النموذج الممثل للزراعة المشتركة بين MCF 10 DCIS و WS 12 TI، لوحظ تكاثر الخلايا المصورة هنا وفي الأشكال التالية (باللون الأحمر)، بالإضافة إلى تحلل DQ collagen four و DQ collagen one الملاحظ هنا وفي الأشكال التالية (باللون الأخضر)، وكذلك تحلل مصفوفات الكولاجين كما يتضح من الانخفاض في حجم الزراعات المشتركة.

تمت ملاحظة المزارع المشتركة الحية ذاتها على مدار 23 يوماً، مع التقاط صور بواسطة المجهر البؤري في الأيام 3 و16 و23 من الزراعة المشتركة. وتتسم التفاعلات في المزارع المشتركة من خلايا Mame بأنها ديناميكية ويمكن أن تتغير بمرور الوقت. فعلى سبيل المثال، وكما يظهر في هذا النموذج ثلاثي الأبعاد للزراعة المشتركة لخلايا Mame في اليوم الثالث، تبدأ الخلايا للتو في التكاثر داخل المصفوفات في هذه اللحظة الزمنية، ولا تزال مستقرة تماماً كما يتضح من غياب الفلورة الخضراء.

ومع ذلك، بحلول اليوم 16، ومع استمرار الخلايا في التكاثر، بدأت أيضاً في تحليل بنية المصفوفة كما هو ملاحظ هنا بواسطة منتجات انقسام الكولاجين DQ، واحد وأربعة باللون الأخضر، والتكسير النشط للمصفوفة بواسطة الخلايا حيث تظهر المصفوفة والخلايا بفلورة مشتركة كما هو ملاحظ باللون الأصفر. وبحلول اليوم 23، تحلل ما يقرب من نصف المصفوفة بواسطة الخلايا التي تتكاثر بسرعة مقارنة باليوم الثالث عندما كان حجم المزرعة المشتركة 110,000 cubic micrometers. ومن اليوم 16 إلى 23، انخفض الحجم إلى 46,250 cubic micrometers فقط في هذا اليوم.

في المزرعة المشتركة، يمكن ملاحظة تحلل بروتين كولاجين DQ النوع الرابع عند سطح خلايا DCIS باللون الأحمر، والتحلل المنتشر لكولاجين DQ النوع الأول في المناطق القريبة من الخلايا الليفية باللون الأبيض. كما تسمح الصبغة التفريقية المستخدمة في هذه المزرعة المشتركة بمراقبة أنماط الهجرة والتكاثر المتميزة لنوعي الخلايا بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال سرطان الثدي لاستكشاف تأثيرات البيئة الكلية للورم على تطور السرطان، مع توفير تصوير حي للخلايا للتفاعلات الديناميكية بين الخلايا السرطانية وخلايا السدى المحيطة بها.