إعداد فردية ذبابة الفاكهة البيض غرف للتصوير لايف

تهدف التجربة التالية إلى تسجيل العمليات الديناميكية في مواقع U الحية في ذباب الفاكهة (drosophila). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل المبيضان السليمان من ذباب الإناث بعمر يومين والتي حصلت على تغذية جيدة. وكخطوة ثانية، يتم استخراج الأريولات (aerials) الفردية من المبيضان لتصوير حجرات البيض.

وبعد ذلك، إذا كانت تعبر عن بروتين فلوري مناسب، يمكن تصوير غرف البيض الفردية مباشرة أو إخضاعها لمزيد من المعالجات، مثل الحقن المجهري لعلامات فلورية قبل التصوير. وفي النهاية، ومن خلال تحليل تسلسلات الفيديو، يمكن الكشف عن التفاعل الديناميكي للمكونات داخل الخلوية. وقد ساعدتنا هذه الطريقة في الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مجال نقل RNA والترجمة الموضعية.

على سبيل المثال، كيف يتم تنظيم تعبير البروتينات التي تحدد مخطط الجسم من حيث الوقت والمكان في الكائن الحي؟ وبوجه عام، سيواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأنها تتطلب سرعة وبراعة ملحوظتين، لذا سيؤدي التدريب المستمر إلى تحقيق نتائج أفضل.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة نقل كيفية التعامل مع غرف البيض نصياً، ولأن الأمر يتطلب خبرة تقنية وصبرًا ودقة في التنفيذ. ابدأ هذا الإجراء بوضع قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون على غطاء شريحة ثم اتركها جانباً. بعد ذلك، قم بتخدير الذباب المجهز باستخدام ثاني أكسيد الكربون.

استخدم ملقطًا دقيقًا حاد الرأس للإمساك بذبابة أنثى سمينة من الجهة الأمامية للبطن. تجنب الإمساك بها من منتصف البطن. أمسك الأنثى على ارتفاع يتراوح بين سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات تقريبًا فوق الشريحة الغطائية المجهزة.

باستخدام زوج ثانٍ من الملاقط، قم بإزالة الأنسجة الموجودة في الطرف الخلفي الأقصى للأنثى. وعادةً ما يشمل ذلك أنسجة الأمعاء باستخدام ملاقط نظيفة. قم بتدليك البطن برفق من الطرف الأمامي إلى الطرف الخلفي، على غرار الضغط على أنبوب معجون الأسنان لإخراج محتوياته.

تبدو المبيضات كبنى عاتمة كبيرة وستلتصق بطرف الملقط. يتم جمع المبيضات عن طريق لمسها لزيت الكربون الهالو الموجود على الشريحة. ثم تكرر هذه العملية حتى يتم جمع من أربعة إلى ستة مبيضات.

قبل عزل الهوائيات، اضبط مصدر الضوء في المجهر بحيث يسقط الضوء على الشريحة بزاوية ضحلة، مما يؤدي إلى تكوين ظلال متباينة على الأنسجة. عند تشريح الذباب، من المهم جداً استخدام الأدوات المناسبة.

إن المؤشر الذي نستخدمه ليس حاداً جداً حتى لا يتسبب في تلف الأنسجة، ولكنه ثلم بما يكفي لتمكننا من الإمساك بالملاقط التي نستخدمها. ومرة أخرى، هي ليست حادة جداً لدرجة إتلاف الأنسجة، ولكنها دقيقة بما يكفي لتمكيننا من تحريك الأشياء دون ثني الأداة. كما أنه من المهم جداً أن تكون الأدوات نظيفة، لذا نقوم بتنظيفها بانتظام طوال الإجراء باستخدام ملقط مغلق.

افصل المبيضين عن طريق إزالة الأنسجة الرابطة عند الطرف الخلفي. حيث يحتوي الطرف الخلفي على أكثر حجرات البويضات نضجاً. وجّه المبيض أفقياً بحيث تكون أصغر حجرات البويضات سناً باتجاه يدك المهيمنة.

بعد ذلك، أمسك الطرف الخلفي برفق بواسطة النسيج الضام المتبقي، واستخدم مسبار تشريح أو إبرة تنغستن لفصل غرف البيض الفردية؛ حيث ستنفصل غرف البيض من مرحلة Jamar إلى المرحلة 10 عن بعضها البعض، بينما تظل غرف البيض الأكبر سناً متصلة بالمبيض. باستخدام المسبار، اسحب بعناية من 15 إلى 25 من الأريولا (aerials) المنفصلة إلى مركز قطرة الزيت. إذا كانت هناك حاجة لتشريح أكثر من مبيض واحد، فاختر مبيضاً آخر من ذبابة مختلفة.

تخلص من أي أنسجة مبيض زائدة واعمل بسرعة لأن الخلايا البيضية ستبدأ في إظهار تغيرات نمطية ظاهرية نتيجة للإجهاد. بعد مرور 40 دقيقة من التشريح من المبيض، قم بإزالة أنسجة المبيض الزائدة من الزيت. باستخدام أدوات نظيفة لحقن الخلايا البيضية في مرحلتها المتوسطة، قم بتوجيه المبيضين بشكل عمودي على المحور الطولي لغطاء الشريحة. وذلك لعزل غرف البيض في مراحلها المتأخرة.

تتطلب عملية الإمساك بالجزء الخلفي من المبيض، كما تم وصفها سابقاً، طريقة مختلفة. أدخل مسبار التشريح في الطرف الخلفي للمبيض بالقرب من الملقط. ولتجنب ثقب حجرات البيض، أدخل المسبار بين حجرات البيض في مراحلها المتأخرة.

اسحب إبرة التشريح عبر المبيض حتى تخرج عند غرف البيض في مراحلها المبكرة. عند تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح، سيقوم المسبار بإزالة النسيج الضام الذي يثبت الزوائد وغرف البيض في مراحلها المتأخرة في مكانها. كرر هذه الخطوة حتى تنتشر الزوائد على شريحة التغطية.

تكتمل هذه الخطوة عندما لا تعود حجرات البيض مكدسة فوق بعضها البعض. باستخدام مسبار التشريح، افصل حجرات البيض في المراحل المتأخرة لتسهيل التصوير من أجل وضع المرحلة 14. استخدم الملاقط للإمساك بالزوائد الظهرية لحجرات العنق.

قم بتحضير المحاليل المراد حقنها عن طريق طرد مركزي قصير للأنبوب بسرعة عالية، وذلك لترسيب أي رواسب صلبة قد تتسبب في انسداد إبرة الحقن. بعد ذلك، قم بتعبئة إبرة الحقن باستخدام رأس تعبئة، ثم ثبت إبرة الحقن المعبأة بعناية في جهاز الحقن.

ضع الآن قطعة صغيرة من الزجاج بجانب العينات وثبّت الشريحة على منصة المجهر. ستعمل قطعة الزجاج كحاجز لكسر أو فك الارتباط. افصل الإبرة.

قم بتجهيز المجهر وجهاز الحقن للتجربة، مع الحرص على عدم كسر طرف الإبرة. وإذا كان ذلك ممكناً، استخدم منصة آلية تتميز بخاصية زيارة النقاط لتحديد جميع خلايا المرحلة الثامنة والمرحلة التاسعة المراد حقنها.

الآن، اخفض إبرة الحقن حتى تلامس الزيت. اختر النقطة الأولى من قائمة النقاط المحددة وركز على الخلية. اخفض الإبرة يدويًا حتى تصبح في نفس المستوى البؤري للخلية.

باستخدام عناصر التحكم في الملاعب، حرك رأس إبرة الحقن حتى تصبح داخل الموقع U. وغالباً ما تكون حركة الطعن السريعة أكثر نجاحاً من الحركة البطيئة. وبمجرد الدخول، قم بحقن حجم صغير من الإبرة وقيم التأثيرات بصرياً.

يلزم تكرار العملية. إذا كانت عملية الحقن ناجحة، فسيتم إزاحة السيتوبلازم الموجود داخل الخلية. ومن الصعب تحديد الكمية الدقيقة للسائل المحقون.

لزيادة حجم الحقن، قم بتعديل الضغط أو مدة نبضة الحقن. قم بكسر طرف الإبرة لزيادة فتحة الإبرة قليلاً، أو ببساطة استخدم نبضات حقن متعددة قبل اختيار الخلية (Cyte) التالية. ارفع إبرة الحقن عالياً بما يكفي في الزيت بحيث لا تصطدم بالخلايا الأخرى.

إن الوخز المتكرر أو إبقاء الإبرة لفترة طويلة داخل الخلية يؤدي إلى تلف شديد في حجرة البيضة. لذا يجب توخي السرعة، حيث ينبغي أن تستغرق عملية الحقن أقل من 10 ثوانٍ.

في حال حدوث خطأ، انتقل إلى العلامة التالية في الموقع. لا تضيع الوقت في المواقع التالفة. وعندما تنسد الإبرة، قم بتحريك الإبرة إلى قطعة الزجاج المكسورة.

مع وجود الزجاج والإبرة في نفس المستوى البؤري، ادفع الإبرة برفق داخل الزجاج. اختبر ما إذا كانت الإبرة غير مسدودة عن طريق الضغط على زر الحقن والتأكد من خروج أي سائل من طرف الإبرة. عند الانتهاء من الحقن في جميع مواقع الموجات فوق الصوتية (US)، حرك الإبرة يدويًا خارج الزيت ووجهها بعيدًا عن مسار شعاع المجهر.

تأكد من وضعها في اتجاه آمن لتجنب تلف العين، مع إطفاء الأنوار. يُعد تسريع عملية التصوير الفلوري أمرًا ضروريًا. إذا انقضت ساعة أو أكثر بين عزل غرفة البيضة وحقن الخلايا، فستصعب عملية حقن الخلايا وستظهر عليها تغيرات نمطية مرتبطة بالإجهاد.

يمكن أن تنشأ مشكلات مماثلة نتيجة التعامل العنيف مع الخلية أو حقن أحجام زائدة. ويمكن تصوير غرف البيض التي تعبر عن بروتينات فلورية "trenchgenic" دون الحاجة إلى الحقن. كما يمكن تصوير وسم MS two للـ RNA الداخلي بنتائج جيدة باستخدام إجراءات عزل الأنسجة باتباع الإجراء الكامل للتخليق في المختبر in vitro.

تم حقن RNA الخاص بـ Alexa, 5 46 kin في حجرة بيض ME 31 BGFP، حيث تموضع الـ RNA في المنطقة الظهرية الأمامية للخلية وشكل غطاءً حول النواة بمجرد إتقانه. يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون 10 دقائق تقريباً من وقت التشريح وحتى بدء التصوير. وأثناء محاولة إجراء هذه العملية، يجب مراعاة سلامة النسيج من خلال العمل بسرعة وبدقة في آن واحد. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تسجيل العمليات الديناميكية في خلايا Drosophila الحية.