إعداد فردية ذبابة الفاكهة البيض غرف للتصوير لايف

الهدف من التجربة التالية هو تسجيل العمليات الديناميكية في مواقع ذبابة الفاكهة U الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل المبايض السليمة أولا عن إناث الذباب التي تتغذى جيدا على ما يرام يومين. كخطوة ثانية ، يتم استخراج الهوائيات الفردية من المبايض لتصوير غرف البويضات.

ثم إذا عبرت عن بروتين فلوري مناسب ، فقد يتم تصوير غرف البويضات الفردية مباشرة أو قد تخضع لمزيد من التلاعب ، مثل الحقن المجهري لعلامات الفلورسنت قبل التصوير. في النهاية ، من خلال تحليل تسلسلات الأفلام ، يمكن الكشف عن التفاعل الديناميكي للمكونات داخل الخلايا. ساعدتنا هذه الطريقة في الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مجال نقل الحمض النووي الريبي والترجمة الموضعية.

على سبيل المثال ، كيف يتم تنظيم التعبير عن البروتينات التي تضع خطة الجسم في الزمان والمكان في الإشراف الحي؟ بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنها تتطلب سرعة وبراعة كبيرين. كلاهما سيتحقق نتائج أفضل.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب نقل النص على التلاعب بغرف البويضات ولأن الخبرة الفنية للمريض والأيدي المؤكدة مطلوبة. ابدأ هذا الإجراء بوضع قطرة صغيرة من زيت الكربون هالة على زلة غطاء ووضعها جانبا. ثم تخدير الذباب المحضر بثاني أكسيد الكربون.

استخدم ملقطا ناعما حادا للأنف للإمساك بذبابة سمينة في الجزء الأمامي من البطن. لا تمسك في وسط البطن. امسك الأنثى ما يقرب من سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات فوق زلة الغطاء المعدة.

باستخدام زوج ثان من الملقط ، قم بإزالة الأنسجة في أقصى الجزء الخلفي من الأنثى. سيشمل ذلك عادة أنسجة الأمعاء ذات الملقط النظيف. قم بتدليك البطن برفق من الأمام إلى النهاية الخلفية ، مثل عصر معجون الأسنان من أنبوب.

يبدو المبيضان وكأنهما هياكل كبيرة غير شفافة ويلتصقان بنهاية الملقط. اجمع المبايض عن طريق لمسها بزيت الكربون الهالة على الشريحة. ثم كرر العملية حتى يتم جمع أربعة إلى ستة مبايض.

قبل عزل الهوائيات. اضبط مصدر الضوء على المجهر بحيث تضرب الإضاءة الشريحة بزاوية ضحلة وتخلق ظلالا متناقضة على الأنسجة. عند تشريح الذباب ، من المهم جدا استخدام الأدوات المناسبة.

المؤشر الذي نستخدمه ليس حادا جدا لذا فهو يضر بالأنسجة ، ولكنه غير حاد إلى حد ما حتى نتمكن من التقاط الملقط الذي نستخدمه. مرة أخرى ، ليست حادة جدا بحيث تتلف الأنسجة ، ولكنها جيدة بما يكفي حتى نتمكن من التلاعب بالأشياء دون ثني الأداة. من المهم أيضا أن يكون لديك أدوات نظيفة ، لذلك نقوم بتنظيفها بانتظام طوال العملية باستخدام ملقط مغلق.

افصل المبيضين عن طريق إزالة النسيج المتصل في الطرف الخلفي. تحتوي النهاية الخلفية على غرف البيض الأكثر نضجا. قم بتوجيه المبيض أفقيا باستخدام أصغر غرف البيض نحو يدك المهيمنة.

ثم أمسك الطرف الخلفي برفق بواسطة النسيج الضام المتبقي واستخدم إبرة تشريح أو تنجستن لإثارة الهوائيات الفردية ، وسوف تنفصل غرف البيض الفردية من مرحلة جامار إلى المرحلة 10 عن بعضها البعض ، لكن غرف البيض القديمة ستظل متصلة بالمبيض. باستخدام المسبار ، اسحب بعناية من 15 إلى 25 هوائيا منفصلة إلى مركز قطرة الزيت. إذا كان هناك أكثر من مبيض واحد بحاجة إلى تشريح ، فاختر واحدا من ذبابة مختلفة.

تخلص من أي أنسجة مبيض زائدة واعمل بسرعة حيث ستبدأ الخلايا في إظهار التغيرات المظهرية بسبب الإجهاد. بعد 40 دقيقة من تشريح المبيض ، قم بإزالة أنسجة المبيض الزائدة من الزيت باستخدام أدوات نظيفة لحقن الخلايا في منتصف المرحلة ، قم بتوجيه الهوائيات بشكل عمودي على المحور الطويل لزلة الغطاء. لعزل غرف البيض في المرحلة المتأخرة.

مطلوب طريقة مختلفة مع الجزء الخلفي من قبضة المبيض كما هو موضح سابقا. أدخل مسبار التشريح في الطرف الخلفي للمبيض بالقرب من الملقط. لتجنب ثقب غرف البيض ، أدخل المسبار بين غرف البيض في المرحلة المتأخرة.

اسحب إبرة التشريح عبر المبيض حتى تخرج في حجرات البيض في المرحلة المبكرة. عند القيام بذلك بشكل صحيح ، سيقوم المسبار بإزالة النسيج الضام الذي يحمل الهوائيات وغرف البيض في المرحلة المتأخرة في مكانها. كرر هذه الخطوة حتى تنتشر الهوائيات على زلة الغطاء.

عندما لا تكون غرف البيض مكدسة فوق بعضها البعض ، تكتمل هذه الخطوة. باستخدام مسبار تشريح ، افصل غرف البيض في المرحلة المتأخرة لتسهيل التصوير لوضع المرحلة 14. تستخدم غرف الرقبة ملقطا للإمساك بالزوائد الظهرية.

قم بإعداد المحاليل المراد حقنها عن طريق الطرد المركزي لفترة وجيزة للمغفل عالي السرعة. سيؤدي ذلك إلى تكوير أي رواسب صلبة قد تسد إبرة الحقن. ثم قم بتحميل إبرة الحقن بطرف تحميل وقم بتوصيل إبرة الحقن المحملة بعناية بالحاقن.

الآن ضع قطعة صغيرة من الزجاج بجوار العينات وقم بتركيب الشريحة على مرحلة المجهر. سيكون الزجاج بمثابة جدار للكسر أو unc. افصل الإبرة.

تحضير المجهر وجهاز الحقن للتجربة. الحرص على عدم كسر طرف الإبرة. إذا أمكن ، استخدم مرحلة آلية لديها القدرة على زيارة نقطة لتحديد جميع الخلايا في المرحلة الثامنة والمرحلة التاسعة للحقن.

الآن ، اخفض إبرة الحقن حتى تلامس الزيت. حدد النقطة الأولى في قائمة النقاط المحددة وركز على cyte. اخفض الإبرة يدويا حتى تصبح في نفس مستوى التركيز مثل السرية.

باستخدام أدوات التحكم في المناور ، حرك نقطة إبرة الحقن حتى تكون داخل موقع U. غالبا ما تكون حركة الطعن السريعة أكثر نجاحا من الحركة البطيئة. بمجرد الدخول ، أخرج حجما صغيرا من الإبرة وقم بتقييم التأثيرات بصريا.

التكرار مطلوب. إذا نجح الحقن ، إزاحة السيتوبلازم الموجود داخل الخلايا. يصعب تحديد الكمية الدقيقة للسوائل المحقونة.

لزيادة الحجم المحقون ، اضبط الضغط أو مدة نبضة الحقن. اكسر طرف الإبرة لزيادة فتحة الإبرة قليلا ، أو ببساطة استخدم نبضات حقن متعددة قبل تحديد العلامة التالية. سيت. ارفع إبرة الحقن عاليا بما يكفي في الزيت حتى لا تصطدم بالخلايا الأخرى.

الطعن المكثف أو البقاء بالإبرة داخل الخلية يلحق أضرارا جسيمة بغرفة البيض. لذا كن سريعا. يجب أن يستغرق الحقن أقل من 10 ثوان.

إذا ارتكب خطأ، انتقل إلى العلامة التالية إلى موقع إلكتروني. لا تضيع الوقت في تلف البصر. عندما تنسد الإبرة ، انقل الإبرة إلى قطعة الزجاج المكسورة.

باستخدام الزجاج والإبرة في نفس المستوى البؤري ، قم بربط الإبرة برفق في الزجاج. اختبر أن الإبرة غير مسدودة بالضغط على زر الحقن ومعرفة ما إذا كان أي سائل يخرج من طرف الإبرة. عندما يتم حقن جميع المواقع الأمريكية ، حرك الإبرة يدويا خارج الزيت ووجهها خارج مسار الشعاع للمجهر.

تأكد من أنه في اتجاه آمن لتجنب تلف العين ، يتم إطفاء الأضواء. لتسهيل سرعة التصوير الفلوري أمر حتمي. إذا انقضت ساعة أو أكثر بين عزل حجرة البويضة وحقن الخلايا ، فسيكون من الصعب حقن الخلايا وتظهر تغيرات نمطية مرتبطة بالإجهاد.

يمكن أن تنشأ مشكلات مماثلة مع التعامل القاسي مع الخلايا أو حقن الأحجام الزائدة. يمكن تصوير غرف البيض التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت الخنادق دون الحاجة إلى الحقن. يمكن تصوير MS Two الملصقات للحمض النووي الريبي الذاتي بنتائج جيدة باستخدام إجراءات عزل الأنسجة باستخدام الإجراء الكامل في المختبر المركب.

Alexa ، 5 46 أقارب ، تم حقن الحمض النووي الريبي في غرفة بيضة ME 31 BGFP ، والحمض النووي الريبي الموضعي في الجزء الأمامي الظهري للخلية وشكل غطاء حول النواة بمجرد إتقانه. يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي 10 دقائق من وقت التشريح إلى بدء التصوير أثناء محاولة هذا الإجراء ، اعتني بالأنسجة من خلال العمل بسرعة ولكن بعناية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسجيل العمليات الديناميكية في ذبابة الفاكهة الحية.