مصقول وعززت ضعيفة، جمجمة نافذة على المدى الطويل التصوير من مخ الفأر

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نافذة جمجمة رفيعة ومستقرة فوق قشرة الفأر للسماح بالتصوير المتكرر دون تعطيل البيئة داخل الجمجمة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إرفاق حامل الرأس أولا الذي سيسمح بتثبيت الرأس بثبات تحت جهاز التصوير. بعد ذلك ، قم بترقيق الجمجمة بعناية في منطقة فوق السطح الظهري للدماغ وتلميع السطح بحبيبات دقيقة.

ثم قم بتغطية النافذة بقطعة صغيرة من غراء cyanoacrylate وغطاء زجاجي لتعزيز النافذة. الخطوة الأخيرة هي تحضير للتصوير تحت المجهر الفوتوني. في النهاية في الجسم الحي ، يتم استخدام اثنين من المجهريات الفوتونات لإظهار الهياكل الدقيقة مثل الشرايين والشعيرات الدموية والتشعبات العصبية ، والتي يمكن تصويرها حتى عمق 250 ميكرومتر في القشرة على مدار أسابيع.

الميزة الرئيسية لتقنية نافذة الجمجمة هذه هي أن الجمجمة التي تعلو القشرة لا يمكن الوصول إليها. أولا ، نقوم بتخفيف الجمجمة للحصول على الوضوح البصري ، ثم نعزز الجمجمة بغراء cyanoacrylate وانزلاق الغطاء. يجب أن تكون هذه الطريقة مفيدة لدراسة مجموعة متنوعة من الفئران الفلورية المعدلة وراثيا في دول التخدير أو دول منظمة التعاون الإسلامي.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتعقيم الأدوات الجراحية المطلوبة ، وتخدير الفأر في حوالي ثلاثة إلى ستة أسابيع من العمر وفقا للطرق الموجودة في المخطوطة المصاحبة. تحقق من المنعكس عن طريق الضغط على إصبع القدم للتأكد من أن الفأر في المستوى الجراحي للتخدير. بعد ذلك ، قم بتأمين الماوس في إطار تجسيمي.

حافظ على درجة حرارة جسم الفأر عند 37 درجة مئوية. باستخدام مسبار المستقيم المنظم للتغذية المرتدة ووسادة الحرارة. ضع مرهم العين على عينيه للاحتفاظ بالرطوبة.

ثم احلق فروة الرأس باستخدام ماكينة الحلاقة الكهربائية الصغيرة. بعد ذلك ، نظف فروة الرأس باستخدام البيتادين ، متبوعا بمسحها بكحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪. ثم قم بتسخين كمية من السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي المعقم إلى 37 درجة مئوية تحت المجهر.

قم بإزالة فروة الرأس على سطح الجمجمة الظهرية بالكامل باستخدام مقص جراحي. تقليم الجلد بشكل جانبي على حواف العضلات الصدغية على جانبي الجمجمة وخلف عضلات الرقبة. بعد ذلك ، استخدم شفرة مشرط لإزالة السمحاق الرقيق من سطح الجمجمة.

ثم جفف ونظف الجمجمة. بعد ذلك ، ضع طبقة رقيقة من غراء cyanoacrylate على سطح الجمجمة. اترك الغراء يجف تماما.

هذه الطبقة من الغراء مطلوبة للالتصاق السليم بأسمنت الأسنان. في الخطوات اللاحقة. لإعداد التصوير المستيقظ ، قم بحفر ثقوب وإدخال اثنين من البراغي رقم 0 0 0 في سطح الجمجمة المقابل.

ثم قم بتوصيل موصل صلب مخصص مع نقطتي ربط بالجمجمة. هذا يقلل بشكل كبير من درجات الحرية ويبسط نقل نفس مجال التصوير في الدراسات الطولية. يوفر العارضة العريضة أيضا مساحة واسعة لوضع القطب الكهربائي وتحفيز الحيوية.

بعد ذلك ، قم بتغطية سطح الجمجمة بالكامل ، باستثناء موقع النافذة بطبقة من الأسمنت السني ، وتأكد من تغطية جميع حواف الجلد المكشوفة بالأسمنت. قبل ترقق الجمجمة ، تأكد من أن أزيز الحفر حادة وتجنب إعادة استخدامها. استخدم مثقاب الأسنان بسرعة منخفضة لتخفيف منطقة ملليمترين في ملليمترين فوق القشرة الحسية الجسدية مع نتوء نصف ملليمتر.

ثم قم بترقيق سطح الجمجمة الجاف لبضع ثوان فقط في كل مرة باستخدام الجمجمة باستخدام السائل الدماغي النخاعي بشكل دوري لمنع التسخين. ثم رقيق العظام. قم بتبديل المثقاب إلى سرعة أبطأ وحلق سطح الجمجمة بلمسات طفيفة فقط.

يجب أن يقترب المثقاب من السطح بزاوية 30 درجة تقريبا من الرأسي. استمر في ترقق العظم بعد طبقة الأوعية الدموية إلى الطبقة الثانية من العظام. فوق سطح الدماغ.

امسك المثقاب بحركات صغيرة خاضعة للرقابة وقم بتطبيق القوة فقط في الاتجاه الجانبي. عندما يبلغ سمك العظم حوالي 50 ميكرون ، يجب أن تكون أوعية التقشير مرئية بوضوح من خلال العظم الرطب. في هذا العمق ، ستصبح البقع البيضاء الصغيرة داخل العظام مرئية لبضع ثوان.

مباشرة بعد ترطيب سطح الجمجمة الجاف ، يجب أن يكون سمك العظم النهائي حوالي 10 إلى 15 ميكرون. عندما يكون العظم رقيقا بدرجة كافية ، لن تكون البقع البيضاء الصغيرة في العظم مرئية عند ترطيب سطح الجمجمة الجاف. الآن قم بتلميع النافذة بمسحوق أكسيد القصدير.

استخدم رشة صغيرة من المسحوق بحجم ربع حجم النافذة تقريبا ، وقم بتحريك ملاط من المسحوق باستخدام السائل النخاعي باستخدام مثقاب مسبق الصنع بسوط السيليكون. قم بتلميع السطح لمدة 10 دقائق ، وقم بإزالة مسحوق أكسيد القصدير من النافذة جيدا وجفف العظام. يجب أن تساعد هذه العملية في تقليل أي حواف خشنة تتركها لقمة الحفر أثناء إجراء التخفيف.

بعد ذلك ، قم بقص بضع قطع مربعة من زجاج الغطاء رقم صفر بحجم أصغر قليلا من حجم النافذة. استخدم كاتبا لتسجيل الخطوط الأفقية والرأسية المنفصلة برفق في الغلاف. انزلق بحافة مستقيمة دون كسر الزجاج.

ثم ضع زلة الغطاء في طبق بتري. افصل القطع الزجاجية عن طريق ضرب الطبق على حافة الطاولة. بعد ذلك ، ضع القليل من غراء Sano ACRL على النافذة باستخدام الطرف الخشبي لقضيب قطني مكسور.

ضع بسرعة قطعة من زجاج الغطاء المقطوع مسبقا فوق الغراء. تجنب تكوين فقاعات تحت زجاج الغطاء بعد السماح للغراء بالجفاف تماما لأكثر من 15 دقيقة. قم بإزالة غراء سيانواكريليت الزائد من السطح العلوي لزجاج الغطاء بشفرة مشرط.

أغلق حواف النافذة بالأسمنت الأسنان. ثم قم بتشكيل بئر مرتفع قليلا للاحتفاظ بالماء لعدسة الغمس في النهاية. ضع في قفص دافئ حتى يتعافى تماما من التخدير.

في هذه الخطوة ، قم بتثبيت على لوح تجارب بصري للتصوير واستخدم الإطار كدعم للرأس. يمكن لصفيحتنا المنفصلة نقل وجميع أجهزة المراقبة الفسيولوجية المجمعة كوحدة واحدة بين موقعي التصوير الجراحي وموقعي تصوير الفوتون. إذا كان تصوير تدفق الدم مطلوبا ، فقم بحقن 0.05 مل من صبغة ديكستران الفلورية بنسبة 5٪ عبر الوريد تحت الحجاج من أجل تسمية مصل الدم.

يجب أن يتم ذلك تحت التخدير العام وعادة ما تبقى الصبغة في الدورة الدموية لعدة ساعات. حقن محلول رنين مرهب داخل الصفاق بحجم ثلاثة ميكرولتر لكل جرام كل ساعتين للحفاظ على سوائل الجسم ومتطلبات الطاقة. أيقظ الفأر عن طريق التوقف عن الأيزوفلوران.

بعد ساعة واحدة من الاستيقاظ ، يصبح الماوس جاهزا للتصوير. أغلق القفص فوق المجهر لمنع التلوث الضوئي. تفعيلك. فيما يلي مثال على الأوعية الدموية القشرية للفخذ ، فأر YFP واحد تم تصنيفه عن طريق الحقن الوريدي لأوعية تكساس الحمراء المترافقة في تكساس غالبا ما تكون مرئية قليلا فوق السطح القشري في الأم الجافية.

الشرايين الكبيرة وتقع على السطح القشري. تتفرع الأوعية المخترقة من هذه الشبكة السطحية وتغوص في القشرة حيث تتشعب في سرير شعري كثيف يغذي الأنسجة القشرية. يظهر هذا الفيلم الأوعية الدموية على سطح التقشير في فأر مستيقظ.

يمكن رؤية التذبذبات العفوية في قطر الشرايين عندما يكون في حالة راحة هادئة. يجب أن تكون هذه الطريقة مفيدة لدراسة مجموعة متنوعة من الفلورية العابرة للصوت إما في حالة التخدير أو اليقظة.