مصقول وعززت ضعيفة، جمجمة نافذة على المدى الطويل التصوير من مخ الفأر

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نافذة جمجمة رقيقة ومستقرة فوق قشرة الدماغ للفأر للسماح بالتصوير المتكرر دون تعطيل البيئة داخل القحف. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تثبيت حامل للرأس يسمح بتثبيت الرأس بشكل مستقر تحت جهاز التصوير. بعد ذلك، يتم ترقيق الجمجمة بعناية في منطقة فوق السطح الظهري للدماغ وصقل السطح باستخدام حبيبات دقيقة.

بعد ذلك، قم بتغطية النافذة بكمية صغيرة من صمغ السيانوأكريليت وغطاء زجاجي لتعزيز النافذة. الخطوة الأخيرة هي تحضير الحيوان للتصوير باستخدام مجهر الفوتونين. وفي النهاية، يُستخدم مجهر الفوتونين في الجسم الحي لإظهار البنى الدقيقة مثل الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية والزوائد الشجرية العصبية، والتي يمكن تصويرها على عمق يصل إلى 250 micrometers داخل القشرة المخية على مدار عدة أسابيع.

تكمن الميزة الرئيسية لتقنية النافذة القحفية هذه في عدم المساس بالجمجمة التي تغطي القشرة المخية. أولاً، نقوم بترقيق الجمجمة لتحقيق الوضوح البصري، ثم نقوم بتقوية الجمجمة باستخدام غراء السيانوأكريليت وغطاء الشريحة. ينبغي أن تكون هذه الطريقة مفيدة لدراسة مجموعة متنوعة من الفئران المعدلة وراثياً والمؤلقة في حالات التخدير أو حالات OIC.

لبدء هذا الإجراء، قم بتعقيم الأدوات الجراحية المطلوبة باستخدام الموصدة (autoclave)، ثم قم بتخدير فأر يبلغ من العمر حوالي ثلاثة إلى ستة أسابيع وفقاً للطرق المذكورة في المخطوطة المرفقة. تحقق من المنعكس عن طريق قرص إصبع القدم للتأكد من أن الفأر في مرحلة التخدير الجراحي. بعد ذلك، قم بتثبيت الفأر في إطار تجسيمي (stereotaxic frame).

حافظ على درجة حرارة جسم الفأر عند 37 °C، وذلك باستخدام مسبار شرجي منظم بالتغذية الراجعة ووسادة حرارية. ضع مرهمًا عينيًا على عينيه للحفاظ على الرطوبة.

ثم قم بحلاقة فروة الرأس باستخدام ماكينة الحلاقة الكهربائية الصغيرة. بعد ذلك، نظف فروة الرأس باستخدام Betadine، ثم امسحها بكحول isopropyl بتركيز 70%. بعد ذلك، قم بتدفئة جزء من السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي المعقم حتى 37 °C تحت المجهر.

قم بإزالة فروة الرأس عن كامل سطح الجمجمة الظهري باستخدام مقص جراحي. قم بتشذيب الجلد جانبياً وصولاً إلى حواف العضلات الصدغية على كلا جانبي الجمجمة، وخلف عضلات الرقبة. بعد ذلك، استخدم شفرة المشرط لإزالة السمحاق الرقيق من سطح الجمجمة.

ثم قم بتجفيف الجمجمة وتنظيفها. بعد ذلك، ضع طبقة رقيقة من غراء السيانوأكريليت على سطح الجمجمة. اترك الغراء ليجف تماماً.

هذه الطبقة من الغراء ضرورية لضمان الالتصاق السليم للإسمنت السني. في الخطوات اللاحقة، ولغرض التحضير للتصوير أثناء اليقظة، قم بحفر ثقوب وتركيب مسمارين ذاتي الثقب من المقاس 000 في سطح الجمجمة المقابل.

ثم قم بتثبيت موصل صلب مُصنع خصيصًا بنقطتي تثبيت على الجمجمة. يقلل هذا بشكل كبير من درجات الحرية ويسهل إعادة تحديد موقع نفس مجال التصوير في الدراسات الطولية. كما يوفر العارضة العريضة مساحة كافية لوضع الأقطاب الكهربائية وتحفيز الاهتزاز.

بعد ذلك، قم بتغطية كامل سطح الجمجمة بطبقة من الأسمنت السني، باستثناء موقع النافذة، مع التأكد من تغطية جميع حواف الجلد المكشوفة بالأسمنت. وقبل ترقيق الجمجمة، تأكد من أن رؤوس المثقاب حادة وتجنب إعادة استخدامها. استخدم مثقاباً سنياً بسرعة منخفضة لترقيق منطقة بمقاس 2 mm في 2 mm فوق القشرة الحسية الجسدية باستخدام رأس مثقاب بمقاس 0.5 mm.

بعد ذلك، قم بترقيق سطح الجمجمة الجاف لبضع ثوانٍ فقط في كل مرة، مع ريّ الجمجمة بـ CSF بشكل دوري لمنع ارتفاع درجة الحرارة. ثم قم بترقيق العظم. بعد ذلك، قم بتحويل المثقاب إلى سرعة أقل واكشط سطح الجمجمة بلمسات خفيفة فقط.

يجب أن يقترب المثقاب من السطح بزاوية 30 درجة تقريباً من العمود الرأسي. استمر في ترقيق العظم متجاوزاً الطبقة الوعائية وصولاً إلى الطبقة الثانية من العظم، فوق سطح الدماغ.

أمسك المثقاب بحركات صغيرة ومتحكم بها، وطبّق القوة في الاتجاه الجانبي فقط. عندما يصل سمك العظم إلى حوالي 50 microns، يجب أن تكون أوعية التقشير مرئية بوضوح من خلال العظم الرطب. وعند هذا العمق، ستظهر بقع بيضاء صغيرة داخل العظم لبضع ثوانٍ.

بعد ترطيب سطح الجمجمة الجاف مباشرة، يجب أن يتراوح السمك النهائي للعظم بين 10 إلى 15 microns. وعندما يصبح العظم رقيقاً بما يكفي، لن تعود البقع البيضاء الصغيرة في العظم مرئية عند ترطيب سطح الجمجمة الجاف. والآن، قم بتلميع النافذة باستخدام مسحوق أكسيد القصدير.

استخدم كمية صغيرة من المسحوق تعادل تقريبًا ربع حجم النافذة، وقم بتحريك ملاط من المسحوق مع سائل CSF باستخدام ريشة مثقاب جاهزة ذات سوط سيليكوني. قم بتلميع السطح لمدة 10 دقائق، واغسل مسحوق أكسيد القصدير من النافذة تمامًا ثم جفف العظمة. من شأن هذه العملية أن تساعد في تقليل أي حواف خشنة خلفتها ريشة المثقاب أثناء إجراء الترقيق.

بعد ذلك، قم بقص بضع قطع مربعة من غطاء شريحة زجاجية من الرقم صفر، بحيث يكون حجمها أصغر قليلاً من حجم النافذة. استخدم أداة خدش لإجراء خطوط أفقية وعمودية منفصلة برفق في الغطاء. ثم مرر حافة مستقيمة دون كسر الزجاج.

ثم ضع غطاء الشريحة في طبق بتري. افصل القطع الزجاجية عن طريق طرق الطبق على حافة الطاولة. بعد ذلك، ضع كمية صغيرة من غراء Sano ACRL فوق النافذة باستخدام الطرف الخشبي لمطبق قطني مكسور.

ضع بسرعة قطعة مقصوصة مسبقاً من غطاء الزجاج فوق الغراء. تجنب تكوين فقاعات تحت غطاء الزجاج بعد ترك الغراء ليجف تماماً لمدة 15 دقيقة. قم بإزالة الغراء الزائد من مادة cyanoacrylate عن السطح العلوي لغطاء الزجاج باستخدام شفرة مشرط.

أغلق حواف النافذة باستخدام الإسمنت السني. ثم شكل بئراً مرتفعاً قليلاً لاحتواء الماء من أجل عدسة الغمر في النهاية. ضع الحيوان في قفص دافئ حتى يتعافى تماماً من التخدير.

في هذه الخطوة، قم بتثبيت الحيوان على لوحة بصرية (optical breadboard) للتصوير واستخدم الإطار كدعامة للرأس. يمكن للوحة المنفصلة لدينا نقل الحيوان وجميع أجهزة المراقبة الفسيولوجية المجمعة كووحدة واحدة بين موقع الجراحة وموقع التصوير ثنائي الفوتون. إذا كان تصوير تدفق الدم مطلوبًا، فاحقن 0.05 milliliters من صبغة الدكستران الفلورية بتركيز 5% عبر الوريد تحت الحجاج لوسم مصل الدم.

يجب إجراء ذلك تحت التخدير العام، وعادةً ما تظل الصبغة في الدورة الدموية لعدة ساعات. احقن محلول رينجر اللاكتات داخل الصفاق بحجم 3 µL لكل جرام كل ساعتين للحفاظ على سوائل الجسم والاحتياجات الطاقوية. أيقظ الفأر عن طريق إيقاف الإيسوفلوران.

بعد ساعة واحدة من الاستيقاظ، يصبح الفأر جاهزاً للتصوير. أغلق القفص فوق المجهر لمنع التلوث الضوئي. موضح. هذا مثال على الأوعية الدموية القشرية في الفخذ، لفأر YFP واحد تم تمييزه عن طريق الحقن الوريدي لـ dextran المقترن بـ Texas red؛ وغالباً ما تكون الأوعية الجافية مرئية فوق السطح القشري قليلاً في الأم الجافية.

توجد الشرايين والأوردة السطحية الكبيرة على سطح القشرة المخية. وتتفرع الأوعية النافذة من هذه الشبكة السطحية وتغوص في القشرة حيث تتشعب إلى سرير شعيري كثيف يغذي الأنسجة القشرية. يوضح هذا المقطع المرئي الأوعية الدموية عند السطح الخارجي في فأر مستيقظ.

يمكن ملاحظة تذبذبات تلقائية في قطر الشريان عندما يكون الحيوان في حالة راحة هادئة. ومن شأن هذه الطريقة أن تكون مفيدة لدراسة مجموعة متنوعة من الحيوانات التي تخضع للتصوير بالموجات فوق الصوتية الفلورية، سواء كانت في حالة تخدير أو في حالة يقظة.