لونين مناعي (رقاقة) باستخدام ذبابة الفاكهة الأنسجة

يُنتج هذا الإجراء بيانات الترسيب المناعي للكروماتين من أنسجة ذبابة تم تشريحها لتعكس بدقة حالة الكروماتين في أنسجة ذبابة الفاكهة drosophila الحية. وفي هذه الحالة، يتم جمع مئات الخصيتين عن طريق التشريح اليدوي. وتُجرى اختبارات الترسيب المناعي للكروماتين باستخدام جسم مضاد ضد البروتين المستهدف.

يتم إجراء تحليل كمي تالٍ باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي (R-T-P-C-R) للتأكد من إثراء المنطقة الجينومية المحددة في الحمض النووي (DNA) المصفى. بدلاً من ذلك، يتيح التسلسل عالي الإنتاجية لعينة الشريحة إنشاء ملف تعريف شامل للجينوم. وفي النهاية، يوفر تحليل الشريحة للأنسجة المشرحة تمثيلاً لحالة الكروماتين في الخلايا وفقاً لظروفها الفسيولوجية.

تم تحسين هذا البروتوكول لتحليل الأنسجة المعزولة مباشرة من الكائن الحي. ومن أجل الحصول على حالات الكروماتين والمعلومات فوق الجينية تحت ظروف فسيولوجية حقيقية، سنقوم بتوضيح استخدام تقنية chip في ذبابة الفاكهة drosophila لدراسة حالة crumpton. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على كائنات أخرى مثل الفأر أو سمكة الزيبرا zebrafish.

يعد العرض المرئي لهذا البروتوكول أمراً بالغ الأهمية للحصول على DNA بجودة وكميات كافية لاستخدامه في الرقاقة أو لإنشاء مكتبات التسلسل للتسلسل عالي الإنتاجية. أولاً، قم بتشريح النسيج المطلوب، وفي هذه الحالة حوالي 200 زوج من خصى Drosophila في PBS بارد يحتوي على مثبط البروتياز و100 micrograms per milliliter من PMSF. بعد شطف النسيج مرتين، قم بإعادة التعليق في 200 microliters من محلول PBS نفسه مع المثبطات.

بعد ذلك، يتم تثبيت العينة بإضافة 5.5 µL من الفورمالدهيد بتركيز 37% المسخن. تُحضن العينة عند 37 °C لمدة 15 دقيقة. مع الرج باستخدام جهاز Vortex كل خمس دقائق، تُترك الأنسجة لتستقر على الثلج.

اشطف مرتين باستخدام 450 µL من PBS المحتوي على المثبطات. تُحفظ العينات في درجة حرارة -20 °C. اجمَع عينات 200 oph testes في أنبوب einor سعة 1.75 mL.

قم بشفط المنظم ثم أعد تعليق العينات في 200 µL من منظم التحلل. قم بتفكيك النسيج تماماً باستخدام مجانس أزرق، مع التأكد من عدم بقاء أي تجمعات، ثم حضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بتجزئة العينة باستخدام جهاز sonication دقيق، واتركها في الثلج لمدة 50 ثانية. كرر العملية من أربع إلى خمس مرات للحصول على الحجم الأمثل للجزيئات المناسبة لاختبار ChIP. ثم خفف المحلول باستخدام 1.8 milliliters من ripper buffer لتحضير مخزون من مستخلص الكروماتين. ولضمان نجاح مقايسة ChIP، من الضروري تحديد حجم جزيئات DNA تجريبيًا.

لذا، نحتاج إلى إجراء الفصل الكهربائي للهلام للمضي قدماً في تجربة الشريحة. بالنسبة لعينة التحكم في المدخلات، اسحب 50 µL. أضف 2 µL من كلوريد الصوديوم بتركيز 5 M واحضنها عند 65 °C طوال الليل.

لعكس عملية الربط التشابكي، ابدأ بربط الجسم المضاد بالبروتين. خرزات A في أنبوب فندور سعة 1.5 milliliter. أضف 40 µL من خرزات protein A و 600 µL من PBS مع الرج عند درجة حرارة 4 °C لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، ضع الخرزات على المغناطيس وتخلص من السائل الطافي. الآن أضف 100 µL من PBS بالإضافة إلى الأجسام المضادة المطلوبة. قم بتحضين المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد جمع الخرزات باستخدام المغناطيس، أضف 1 mL من مستخلص كروماتين الأنسجة. قم بالتدوير في درجة حرارة 4 °C طوال الليل. بعد ذلك، ضع عينة الشريحة على مغناطيس وقم بإزالة السائل العلوي.

قم بغسل الخرزات التي تم جمعها باستخدام غسولات بحجم 1 ml عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق لكل غسلة، ثم أعد تعليق الخرزات في 100 µL من TEA buffer. لعكس الربط التشابكي لمعقدات البروتين والحمض النووي (protein DNA complexes)، أضف 3 µL من SDS بتركيز 10% و5 µL من Proteinase K بتركيز 20 mg/mL، ثم قم بالتحضين عند درجة حرارة 65 °C طوال الليل.

قم بترسيب الحبيبات باستخدام مغناطيس. انقل الطافي الذي يحتوي على DNA إلى أنبوب جديد. اغسل الحبيبات مرة واحدة، ثم اجمع السوائل الطافية التي تحتوي على DNA.

بعد ذلك، قم بتنقية DNA باستخدام استخلاص الفينول والكلوروفورم وانقل الطبقة المائية العلوية إلى أنبوب جديد. قم بترسيب DNA باستخدام 20 µg/mL من الأكريلاميد الخطي أو الجليكوجين، و20 µL من خلات الصوديوم بتركيز 3 M و500 µL من Ethanol بتركيز 100%.

امزج جيداً ثم حضّن عند درجة حرارة 80- °C لمدة 10 دقائق. قم بترسيب DNA عن طريق الطرد المركزي. تخلص من السائل الطافي واغسل الراسب مرة واحدة باستخدام 300 µL من ethanol بتركيز 70% بعد التجفيف بالهواء.

أعد تعليق كريات DNA في 50 µL من منظم TE. احفظ عينات DNA المستخلصة عند -20 °C. جهز تخفيفات تسلسلية لـ DNA الجينومي من أجل منحنى القياس.

في لوحة ذات 96 بئراً، وباستخدام قوالب من الحمض النووي الجينومي المخفف كعينة تحكم داخلية أو مجموعة DNA مقطعة، يتم إعداد تفاعل QPCR بحجم 20 µL في مكررات، ثم تُوضع اللوحة ذات الـ 96 بئراً في جهاز تدوير الألواح الصغيرة (mini plate spinner). يتم تشغيل لوحة العينات في نظام realtime PCR للتحقق من صحة البيانات. أولاً، يتم التأكد من وجود قمة واحدة في مخطط التفكك الحراري، مما يشير إلى وجود مضخم (amplicon) واحد ناتج عن تفاعل PCR.

بعد ذلك، قم برسم المنحنى القياسي. وباستخدام البيانات المستمدة من سلسلة الحمض النووي الجينومي المخفف، احسب الصيغة التي تحدد كمية DNA وفقاً لعتبة الدورة Ct. حدد أيضاً الطور الخطي للتضخيم الأسي لتفاعل PCR لكل مجموعة من البادئات.

إذا كانت قيمة CT لكل من عينات DNA الرقاقة وعينات التحكم المدخلة ضمن النطاق الخطي لقيمة CT، يتم حينئذٍ حساب نسبة إثراء DNA الرقاقة مقارنة بالمدخلات المأخوذة في الاعتبار. قم بتخفيف وإصلاح نهايات 0.1 إلى 5 µg من DNA الرقاقة في تفاعلات بحجم 50 µL تحتوي على T4 DNA polymerase و T4 polynucleotide kinase. ووفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، يتم التحضين لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بتنقية الـ DNA باستخدام طقم تنقية تفاعل MinLu. استمر في إضافة بروزات إلى الطرف '3 باستخدام DNA polymerase وقطعة كبيرة من CLA NOW و dATP، مع التحضين لمدة 30 دقيقة عند 37 °C. مرة أخرى، مرر التفاعل عبر عمود دوران لتنقية وتركيز الـ DNA.

باشر بإجراء عملية الربط باستخدام أوليغو الموائم (adapter oligo). اخلط باستخدام T four DNA Ligase من شركة Illumina وحضن المزيج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بمعالجة العينة باستخدام مجموعة تنقية تفاعل MinLu.

استخلاص الـ DNA في 20 µL. بعد ذلك، يتم فصل عينة الـ DNA عن طريق الفصل الكهربائي باستخدام جهاز egel. يتم عزل النطاق الذي يتراوح بين 200 إلى 400 زوج قاعدي في الهلام وتنقيتة باستخدام طقم استخلاص الهلام KYOGEN.

الآن، قم بتضخيم المكتبة باستخدام بادئات الطرفين المزدوجين (paired end primers)، وإنزيمي fusion HF و pH من شركة Illumina من خلال 20 دورة من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ثم قم بعزل قطع DNA التي يتراوح طولها بين 200 و 400 زوج قاعدي على هلام AOSE قياسي بتركيز 2% لإجراء تسلسل عالي الإنتاجية باستخدام برنامج Ellen. قم بمحاذاة جميع القراءات مع جينوم drosophila، مع السماح بما يصل إلى عدم تطابقين مع التسلسل المرجعي.

احتفظ بالقراءات ذات التعيين الفريد للتحليل اللاحق في حالة وجود قراءات متطابقة متعددة. احتفظ بما يصل إلى ثلاث نسخ لتقليل احتمالية حدوث انحيازات ناتجة عن تضخيم PCR. بعد ذلك، استخدم نصاً برمجياً بلغة Python لتحويل مخرجات مسار عمل GA إلى ملفات بيانات قابلة للتوسيع في المتصفح.

قم بتعيين حجم نافذة مكون من أربعة أزواج قاعدية وحجم قطعة DNA مكونة من 160 زوجاً قاعدياً. صنف جينات الذبابة الدروسوفيلا إلى جينات صامتة وجينات مُعبر عنها بناءً على قيمة RPKM. بالنسبة للرقم الرقمي، حدد الجينات التي تساوي قيمة RPKM فيها صفراً.

باعتبارها مجموعة صامتة، صنف الجينات التي تزيد قيمة RPKM الخاصة بها عن واحد إلى مجموعة معبرة تتكون من ثلاث مجموعات فرعية ذات مستويات تعبير منخفضة ومتوسطة وعالية. وأخيرًا، قارن بين مستويات تعديل الهيستون والتعبير الجيني باستخدام نص برمجي بلغة Python تم وصفه سابقاً في basal 2007، "حقيبة الكرات الرخامية" (bag of marbles). تعاني الخصيتان الطافرة من فشل في الانتقال من الخلايا النطافية التكاثرية إلى الخلايا النطافية المتمايزة.

تستخدم تجربة qPCR على الشريحة هذه خصيتي BAM كمصدر لخلايا جرثومية غير متمايزة لاستقصاء حالة الكروماتين لجينات رئيسية مطلوبة لتمايز الحيوانات المنوية، وإثراء تعديل الهيستون، H3K27me3 أو H3K4me3. يتم تحديد مدى إثراء جينات التمايز عن طريق التطبيع بالنسبة لجين cyclinga الذي يتم التعبير عنه بشكل تأسيسي. وتظهر جينات التمايز male specific transcription factor 87 (Don Juan) و fuzzy onion، والتي لا يتم التعبير عنها في خصيتي BAM، إثراءً عاليًا لتعديل الهيستون الكابت H3K27me3.

علاوة على ذلك، فهي تخلو من الهيستون النشط. ثالثاً، تعديل الهيستون lysine four methyl three. وهي بصمة كروماتينية نسميها أحادية التكافؤ (monovalent)، وذلك على عكس التكافؤ الذي يجمع بين كل من histone three lysine form methyl three وhistone three.

يزداد إثراء Lysine 27 methyl three في جينات التمايز في الخلايا الجذعية الجنينية. بيانات تسلسل Chip باستخدام المجموعة ذاتها من الأجسام المضادة. تأكيد نتيجة chip QPCR الموضحة في الشكل 1 A؛ حيث تظهر المناطق الجينومية لجميع جينات التمايز النهائية الثلاثة المختبرة إثراءً عالياً بـ three lysine, 27 methyl three، ولكن ليس بـ histone three, lysine four methyl three.

في المقابل، يظهر cyclin aging الذي يتم التعبير عنه بشكل تأسيسي مستوىً عالياً من histone three lysine, four methyl three، ولكن مستوىً منخفضاً من histone three lysine 27 methyl three بالقرب من موقع بدء النسخ الخاص به. يوضح هذا الشكل بيانات ChIP-seq لتعديلين هيستونيين بالقرب من مواقع بدء النسخ لأربع فئات من الجينات المعبّر عنها بشكل متفاوت. يتركز histone three, lysine 27 methyl three في اتجاه المصب من مواقع بدء النسخ، وهو ما يرتبط عكسياً بمستوى التعبير الجيني.

تظهر الجينات الصامتة أعلى مستوى من ميثيلة الهيستون 3 ليسين 27 ثلاثية الميثيل (histone three lysine 27 methyl three)، بينما لا تظهر الجينات عالية التعبير أي ارتباط بـ histone three lysine 27 methyl three، وهو ما يتفق مع الدور الكابت لـ histone three, lysine 27 methyl three في التعبير الجيني. وعلى العكس من ذلك، أظهر إثراء تعديل histone three, lysine four methyl three حول مواقع بدء النسخ ارتباطاً عكسياً مع مستوى التعبير الجيني، وهو ما يتفق مع الدور المنشط لـ histone three, lysine four, methyl three في التعبير الجيني.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها بشكل صحيح خلال يومين إلى ثلاثة أيام. لا تنسَ اتخاذ احتياطات السلامة عند استخدام الفينول والكلوروفورم والفورمالديهايد. نأمل أن يكون هذا البروتوكول قد منحك فهماً كافياً لاستخدام الترسيب المناعي للكروماتين من أجل دراسة مشهد الكروماتين في الأنسجة الحية.