المشعة في الموقع التهجين، لتحديد متنوعة أنماط التعبير الجيني في الأنسجة

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد مناطق تعبير جيني معينة وتوصيف توقيت ومستويات التعبير الجيني للمساهمة في فهم وظيفة الجينات. ويتم تحقيق ذلك من خلال الحصاد والتحضير السريع للأنسجة التي ستُستخدم في الإجراء للحفاظ على سلامة الأنسجة. وكخطوة ثانية، يتم معالجة الأنسجة لتقليل الارتباط الخلفي للمجسات الريبوزية (ribo probes).

بعد ذلك، يتم تهجين مسابير ribo مع النسيج، ثم يتم تصور ارتباط مسبار RIBA. وباستخدام فيلم الأشعة السينية أو مستحلب حساس للضوء، يتم الحصول على نتائج توضح موقع ومستوى التعبير الجيني بناءً على صور الأشعة السينية أو تحليل مجهري بالمجال المظلم والمجال المضيء. وبالاستعانة ببرنامج Image J، هناك عدة خطوات حاسمة يجب تنفيذها بدقة حيث يقع الكثيرون في أخطاء، ومن أهمها منع ظهور الخلفية (background).

هناك عدد من الخطوات التي قد تتسبب في ظهور خلفية، مثل سوء التشبع أو عدم إجراء التهجين في درجة الحرارة المناسبة. وهناك سبب آخر وهو التلوث بـ RNA الذي سيؤدي إلى تحلل مسبار RNA الخاص بك. لذا يجب توخي الحذر لضمان خلو جميع الأدوات والمواد من الـ RNA.

أما النقطة الثالثة فهي أنه عند غمس الشرائح في المستحلب، يجب التأكد من عدم وجود أي تسرب للضوء في الغرفة المظلمة أو تعريض المستحلب للضوء خلال جميع مراحل تلك العملية، والتي قد تستمر لمدة ثلاثة أسابيع. وسيقوم بتقديم هذه التقنية هون تشن، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري. بعد استخراج دماغ حديث وغسله بـ 1x PBS، يتم تضمين الدماغ في وسط OCT tissue tech عن طريق غمر الدماغ في قالب يحتوي على الوسط في درجة حرارة الغرفة.

تأكد من توجيه الدماغ حسب الحاجة لعملية التقطيع. بعد ذلك، ورش الثلج الجاف بالإيثانول، قم بتجميد النسيج عن طريق وضع القالب في خليط الإيثانول والثلج الجاف. مع الحرص على عدم وصول الإيثانول إلى داخل القالب، استخدم جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat) لتقطيع النسيج المجمد إلى شرائح بسمك 10 إلى 12 ميكرون، ثم ثبتها على شرائح super plus المخصصة لأنسجة الدماغ والأنسجة الجنينية.

تتراوح درجة حرارة القطع المثلى بين -18 °C و-20 °C. تُحفظ المقاطع في صندوق شرائح عند درجة حرارة -80 °C. تُنقل الشرائح من التخزين عند -80 °C إلى حامل معدني فوق الثلج الجاف.

بعد ذلك، وأثناء العمل داخل غطاء دخان معتمد، ضع الرف في محلول 4%para formaldehyde تم تدفئته مسبقاً إلى درجة حرارة أعلى من درجة حرارة الغرفة بمقدار ثلاث إلى خمس درجات مئوية. قم بالتحضين لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وبعد التحضين، أخرج الرف من الpara formaldehyde واغسل الشرائح عن طريق غمر الرف في PBS لـ 15 مرة. كرر خطوة الغسل هذه مرتين باستخدام محلول PBS جديد في كل مرة.

بعد ذلك، اغمر الشرائح في محلول منظم للأسيتيلة مُحضّر حديثاً لمدة 10 دقائق لتقليل الارتباط غير النوعي لمسبار RIBA. ثم اغسل الشرائح كما سبق، ولكن باستخدام محلول SSPE بتركيز ضعفين كـمحلول غسيل هذه المرة. قم بتجفيف النسيج من الماء من خلال سلسلة من الإيثانول بتركيزات 70 و95 و100% لمدة دقيقتين في كل محلول.

بعد ذلك، جفف الشرائح في خزانة استخلاص الأدخنة لمدة تتراوح بين 10 إلى 15 دقيقة على الأقل. وبعد تخليق مسبار RIBA، وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب، احسب الحجم المطلوب من مسبار RIBA ومحلول التهجين اللازم لجميع الشرائح. قم بتدفئة خليط تهجين مسبار Ribo مسبقاً عند 65 °C لمدة خمس دقائق.

لمسخ مسبار Ribo، اسحب 100 microliters من محلول تهجين مسبار Ribo ووزعها على غطاء الشريحة. ثم استخدم غطاء شريحة زجاجيًا ثانيًا لنشر المحلول بالتساوي فوق النسيج وغطاء الشريحة. ضع الشريحة أفقيًا ووجهها للأعلى في حامل معدني، وبمجرد تجهيز جميع الشرائح، اغمر الحامل ببطء في حمام زيتي بدرجة حرارة 65 degree Celsius لمدة لا تقل عن أربع ساعات وبحد أقصى 16 ساعة.

يُكون الزيت سداداً محكماً يمنع نفاذ الهواء حول شرائح التغطية بعد عملية التحضين؛ لذا يجب إزالة أي زيت زائد من الحامل المعدني الذي يحتوي على الشرائح. ثم يوضع الحامل في حوض زجاجي أو معدني يحتوي على الكلوروفورم داخل خزانة استخلاص الغازات. تُكرر عملية الغسل باستخدام حوض ثانٍ يحتوي على كلوروفورم جديد.

بعد ذلك، اغمِس الحامل في محلول مكون من 0.1% beta-mercaptoethanol بالإضافة إلى محلول SSPE بتركيز 2× لتفكيك شرائح التغطية وإذابة محلول التهجين الزائد. ثم انقل الشرائح إلى محلول ثانٍ طازج من 0.1% beta-mercaptoethanol ومحلول SSPE بتركيز 2×. انقل الشرائح غير المغطاة إلى حامل جديد في صينية تحتوي على 0.1% beta-mercaptoethanol في محلول SSPE بتركيز 2×، مع تحضينها في هذا المحلول لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لإزالة مسبار RNA غير المرتبط الزائد.

بعد ذلك، انقل حامل الشرائح إلى محلول 2× SSPE مضاف إليه 50% من محلول main wide، المسخن مسبقًا إلى 65 درجة مئوية ويحتوي على beta ME capto ethanol بتركيز نهائي قدره 0.1%، واتركها في الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة، تخلص من هذا المحلول وجميع محاليل الغسل المائية السابقة وكذلك أغطية الشرائح كنفايات مشعة. بعد ذلك، اغسل الشرائح مرتين في محلول 0.1× SSPE المسخن مسبقًا إلى 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في كل مرة.

بعد ذلك، قم بتجفيف النسيج من الماء عبر سلسلة من الإيثانول بتركيزات 70% و95% و100% لمدة دقيقتين في كل محلول. وأخيراً، جفف الشرائح في خزانة استخلاص الغازات لمدة 30 دقيقة على الأقل. أولاً، لتحديد ما إذا كانت هناك إشارة إشعاعية موجودة في النسيج.

ضع الشرائح المجففة في كاسيت تصوير، مع العمل في غرفة مظلمة باستخدام ضوء آمن، ثم ضع فيلم الأشعة السينية فوق الشرائح. تأكد من أن الشرائح تواجه جانب المستحلب للفيلم ثم أغلق الكاسيت. عرّض الشرائح للفيلم لمدة تتراوح من يوم واحد إلى سبعة أيام، وذلك اعتماداً على الوفرة المتوقعة للنواتج النسخية.

بعد اكتمال عملية التعريض، يتم تحميض فيلم الأشعة السينية في محلولي المظهر والمثبت القياسيين. ستظهر إشارة التهجين على شكل مناطق سوداء على الفيلم ناتجة عن حبيبات الفضة المعرضة في المستحلب لتحديد الدقة الخلوية ورؤية الإشارة على النسيج نفسه. تُغمس الشرائح في مستحلب فوتوغرافي ثم تُصبغ بصبغة مضادة.

إذا كانت الشرائح ستخضع لصبغة تباينية باستخدام الكريستال فيوليت، فيجب حينئذٍ إزالة البارافين من المقاطع وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب. وفي هذه المرحلة، وأثناء العمل في الغرفة المظلمة، يُصب الماء المقطر في أنبوب، ثم تُؤخذ كمية من مستحلب NTB ويُخفف المستحلب بالماء المقطر بنسبة واحد إلى واحد.

بعد إذابة المستحلب في حمام مائي بدرجة حرارة 42 °C لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة، انقله إلى وعاء غمس زجاجي في حمام مائي بدرجة حرارة 42 °C لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة. يجب أن يغطي مستوى المستحلب المخفف الآن جميع المقاطع الموجودة على الشريحة عند غمس الشريحة فيه. وفي حال وجود عدد كبير من الشرائح، قد تكون هناك حاجة إلى كمية إضافية من المستحلب.

قم الآن بغمس الشرائح في المستحلب المخفف في حمام مائي عند درجة حرارة 42 °C، ثم جفف الشرائح المغموسة في حاوية مغلقة محكمة ضد الضوء طوال الليل في الغرفة المظلمة أو في فرن عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من ساعتين إلى ثلاث ساعات مع إطفاء الأنوار. بعد التجفيف، انقل الشرائح إلى صندوق شرائح. قم بسد الحواف بشريط كهربائي أسود ثم غطها بورق ألومنيوم.

تُحفظ الصناديق عند درجة حرارة 4 °C لعدة أيام أو أسابيع، وعندما يحين وقت التظهير، تُدفأ الشرائح حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. ثم، وأثناء العمل في الغرفة المظلمة، يتم إخراج الحامل الذي يحتوي على الشرائح من الصناديق وتظهيرها في محلول التظهير codec D 19 عند درجة حرارة 16 °C لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق. بعد ذلك، تُغسل الشرائح المُظهرة في مياه الصنبور عند درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك، يتم تحضين الشرائح مرتين في محلول التثبيت عند درجة حرارة 19 درجة Celsius لمدة ست دقائق في كل مرة، ويمكن تشغيل أضواء الغرفة أثناء فترة التحضين الثانية في المثبت. الآن، تُغسل الشرائح تحت مياه جارية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. ثم، باستخدام شفرة حلاقة، يتم كشط المستحلب من ظهر الشريحة بينما لا تزال مبللة.

أخيرًا، قم بإجراء صبغ تبايني باستخدام crystal violet بتركيز 0.3%، ثم قم بتجفيف الشرائح وتثبيتها وفقًا للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب إذا لزم الأمر. قم بعد ذلك بإزالة أي مستحلب زائد من ظهر الشرائح عن طريق ترطيبها بالماء وكشطها بشفرة حلاقة. اشطف الشرائح في محلول ethanol بتركيز 80% وامسحها بلطف مرة أو مرتين للتخلص من البقايا والغبار.

التقط الصور تحت إضاءة المجال المظلم أو المجال المضيء. قد يتطلب الأمر تكرار خطوات الكشط والتنظيف من مرتين إلى ثلاث مرات للحصول على صور جيدة خالية من جزيئات الغبار، والتي يمكن رؤيتها بسهولة في المجال المظلم باستخدام مجهر تشريحي. الصور التالية هي أمثلة على التصوير الشعاعي الذاتي للتهجين الموضعي من أفلام الأشعة السينية.

تُظهر صورة فيلم الأشعة السينية هذه مقطعاً سهمياً كاملاً لرأس طائر الزيبرا فيش في اليوم الجنيني 10، حيث تم تهجينه باستخدام مسبار ريبو مضاد للمعنى لـ Fox P one. وتُظهر الحبيبات السوداء المعرضة على الفيلم تعبير messenger, RNA كما هو ظاهر داخل الدماغ؛ حيث يتركز تعبير Fox P one messenger, RNA هنا في meso alium stri aum والمهاد الظهري. كما تُظهر صورة فيلم الأشعة السينية مقطعاً من نفس طائر الزيبرا فيش الذي تم تهجينه بمسبار 90 cents RIBA لـ Cuper.

يتركز TF two Co.TF two في النواة المخططة والمهاد البطني. الصور التالية هي أمثلة على التصوير الشعاعي الذاتي للتهجين الموضعي من شرائح غمس مستحلبة. تُظهر هذه الصورة ذات المجال المظلم، والتي تم التقاطها تحت مجهر تشريحي، مقطعًا سهميًا كاملاً لرأس طائر zebra finch في اليوم السادس بعد الفقس، والذي تم تهجينه بمسبار RIBA مضاد للحس تجاه Fox P one.

تظهر حبيبات الفضة البيضاء المكشوفة في المستحلب فوق النسيج تعبير الـ messenger RNA. ويمثل اللون الأحمر صبغة kressel violet. ويمثل شريط المقياس واحد millimeter.

تُظهر الصورة هنا مقطعاً من نفس طائر الزيبرا الفنكي الذي تم تهجينه بمسبار ريبو مضاد للمعنى لـ coop TF two. وتقارن الصور التالية بين الوسم بمضاد المعنى والوسم بالمعنى، وهو ما يُظهر أنماطاً مختلفة موضحة في التصوير الشعاعي الذاتي على أفلام الأشعة السينية لمقاطع من رؤوس أجنة طيور الزيبرا الفنكي في اليوم الجنيني 12. يشير الخط المقطع إلى محيط الدماغ بأكمله، بينما تشير علامة C إلى المخيخ.

يمكن ملاحظة أن الشريط المضاد للمعنى لـ PAC six يتم التعبير عنه في الدماغ، وتحديداً في المنطقة البطينية. ويكشف المقطع المجاور الذي تمت تهجينُه مع شريط المعنى لـ pack six عن عدم وجود تعبير خلفي في جميع أنحاء رأس الجنين، ولكن يظهر تعبير واضح في طبقة الصبغة بالشبكية كما هو الحال في الشريط المضاد للمعنى. وتظهر الصور التالية في C إشارتين للتعبير الجيني وشرائح مغمسة في المستحلب مأخوذة من دماغ طائر الزيبرا فنش خلال المراحل الجنينية المتأخرة تحت رؤى المجال المضيء والمجال المظلم.

تظهر هذه الصورة بالمجال المضيء تعبير D one B في اليوم الجنيني 10. وبسبب التعريض الطبيعي للمستحلب، فإن الوسم الذي يظهر باللون الأسود يكاد يكون غير مرئي بهذا التكبير. وتظهر هذه الصورة مقطعاً وتكبيراً مطابقين لما ظهر في الصورة السابقة، ولكن مع التحويل إلى عرض المجال المظلم الذي يُظهر الوسم باللون الأبيض في المخطط والمهاد.

تظهر هذه الصورة بالمجال المضيء تعبير الشق الثالث في اليوم الجنيني 12. بعد التعرض الزائد للمستحلب، يمكن رؤية العلامة السوداء بسهولة. تشير SC إلى موقع الحبل الشوكي، بينما تشير CB إلى موقع المخيخ.

يتجه الجانب المنقاري نحو اليسار. الصورة المعروضة هنا هي لنفس المقطع وبنفس التكبير، ولكن تم تحويلها إلى عرض المجال المظلم، حيث تظهر العلامات باللون الأبيض في النخاع الشوكي بما يتطابق مع صورة المجال المضيء. وتوضح الصور التالية دقة حبيبات الفضة على المستوى الخلوي.

يظهر هنا وسم الحمض النووي الريبوزي المرسال Fox P one في مقدمة دماغ طائر zebra finch، حيث تظهر حبيبات الفضة كنقاط سوداء فوق الخلايا المصبوغة بصبغة crestal violet. تُظهر هذه الصورة تعبيراً عالي الوفرة فوق الخلايا الفردية في meso alium لدى طائر zebra finch البالغ. وتُظهر هذه الصورة تعبيراً منخفض الوفرة فوق الخلايا الفردية في alium المجاور من نفس المقطع هنا.

يظهر تعبير mRNA لـ Hi Fox. P one messenger في خلايا الـ meso alium في اليوم الجنيني 12.

تبدو الخلايا الجنينية الظاهرة هنا أصغر حجماً وأكثر تراصاً مقارنة بالخلايا البالغة التي ظهرت في الصورتين السابقتين. وأخيراً، تُظهر هذه الصورة تعبيراً منخفض الوفرة فوق الخلايا في الغشاء المحيط (alium) المجاور من المقطع نفسه. وباتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد نوع الخلايا التي يتم التعبير عن الجين المستهدف فيها.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية إجراء التهجين في المعهد. لا تنسَ أن العمل مع الكواشف المشعة يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات مثل تدابير الحماية الشخصية أثناء هذا الإجراء.