التنميط بروتيوم الأكسدة والاختزال ثيول استخدام الطيف النظائر كتلة توصيف

الهدف العام من هذه التجربة هو ملاحظة تأثيرات بكتيريا pseudomona siro PV tomato على البروتينات المنظمة بعمليات الأكسدة والاختزال في نباتات الطماطم. أولاً، يتم تلقيح نباتات الطماطم بـ pseudomona siro PV PV tomato لتحفيز العدوى بالممرض والاستجابة البروتينية. بعد ذلك، يتم التلوين باستخدام DIAM benzine لملاحظة التغيرات في أنواع الأكسجين التفاعلية.

بعد ذلك، قم بإجراء وسم TMT للسيستين من أجل فحص بقايا السيستين المنظمة بالأكسدة والاختزال في البروتينات. ويمكن للنتائج التي يتم الحصول عليها قياس التغيرات بين العينات المعالجة وعينات التحكم. مرحباً، أنا Chen من قسم البيولوجيا ومرفق البروتوميات هنا في جامعة فلوريدا.

تكمن ميزة وسم CTMT الخاص بنا مقارنة بالطرق الحالية مثل وسم الزعانف المغطى بالنظائر، والمعروف أيضاً باسم ASCA، في القدرة على إجراء التحليل المتعدد أثناء تحليل البروتينات المستجيبة للأكسدة والاختزال على نطاق واسع. وبينما سيوفر هذا العرض رؤى حول البروتينات المنظمة بالأكسدة والاختزال في الطماطم استجابةً للإصابة بمسببات الأمراض، يمكن تطبيق التجربة على أنظمة أخرى مثل joof، وmice cu، ونباتات أخرى، وفي ظروف الإجهاد الخاضعة للتحكم. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة بعد أن لاحظنا تباينًا ملحوظًا بين تجارب ICAD لأن هناك وسَمين فقط متاحين.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم خطوات الوسم والإثراء. يجب تقليل التباينات التجريبية بين العينات الموسومة إلى أدنى حد، وتقليل المناطق المزالة لضمان كفاءة الوسم، لنبدأ الآن. ازرع شتلتين من الطماطم المنقولة بحجم متماثل في أصص بقطر 4 بوصات لاستخدامها في مستنبت اللقاح.

نمو كثيف من بكتيريا pseudomonas syringae على طبق KBM. يتم كشط البكتيريا في 20 milliliters من الماء وتحضير لقاح بكتيري بتركيز حوالي 10⁶ colony forming units per milliliter. في لتر واحد من محلول التلقيح المنظم، تُغمس النباتات التي يبلغ عمرها أربعة أسابيع في محلول التلقيح البكتيري لمدة 30 ثانية.

ثم تُغطى على الفور بأكياس بلاستيكية شفافة. وبعد مرور وقت التلقيح المفضل، تُجمع الورقة المتمددة بالكامل وتوضع بحيث يكون الجانب البشروي للأعلى في صبغة DAB بتركيز 1 mg/mL، وتُخضع للترشيح الفراغي لمدة 15 دقيقة. ثم تُحضن الأوراق في الظلام في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

الآن، يتم غلي الأوراق المصبوغة في 95%ethanol لمدة 10 دقائق وتُخزن في 75%ethanol باستخدام هاون للطحن. تُطحن الأوراق التي تم جمعها إلى مسحوق ناعم في نيتروجين سائل. بعد ذلك، يتم إجراء استخلاصات الفينول كما هو موضح في النص المصاحب.

بعد ذلك، يتم ترسيب البروتينات المستخلصة بالفينول باستخدام خمسة أضعاف حجمها من خلات الأمونيوم الباردة بتركيز 0.1 molar في ميثانول 100%. تُجمع البروتينات عن طريق الطرد المركزي، ثم تُغسل الراسبة. بعد ذلك، يُعاد تعليق العينات في 1.5 milliliters من إيثانول 70% البارد، وتُنقل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة zwei milliliters.

بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من الطافي الإيثانولي وجفف الراسب لفترة وجيزة باستخدام جهاز التجفيف بالتفريغ السريع (speed vac)، ثم أذب العينات في محلول منظم لاستخلاص البروتين ممسخ. وبعد الطرد المركزي لتكوين راسب، اجمع الطافي وقم بقياس تركيز البروتين وفقاً لدليل الشركة المصنعة. وبالنسبة لكل من علامات الكتلة الست، ابدأ بـ 100 micrograms من عينة البروتين في حجم متساوٍ من محلول منظم للألكلة بتركيز 200 millimolar IO acetamide مُحضّر حديثاً لمنع مجموعات الثيول الحرة، مع التحضين عند 37 degrees Celsius لمدة ساعة. ثم لترسيب البروتينات، أضف 1 milliliter من الأسيتون البارد بتركيز 80% وضعه في درجة حرارة minus 20 degrees Celsius طوال الليل.

قم بترسيب البروتين عن طريق الطرد المركزي واجرِ ثلاث عمليات غسل باستخدام 80% acetone. بعد تجفيف العينات في الهواء على الثلج، أعد تعليق الراسب في 50 µL من محلول التحلل المنظم (lysis buffer). بعد ذلك، ولتقليل روابط ثاني كبريتيد، أضف 0.5 µL من 100 mM TCEP واترك العينات للحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

قم بإذابة العلامات عن طريق إضافة 20 µL من الأسيتونيتريل إلى أنابيب الكواشف. استخدم جهاز الرج الميكانيكي (Vortex) ثم قم بالطرد المركزي لترسيب السوائل. بعد ذلك، ولإزالة TCEP الزائد، قم بتحميل 50 µL من العينة على عمود MicroCon 3 KD. أضف 50 µL من منظم التحلل (lysis buffer) واطرد مركزياً لمدة 15 دقيقة عند 10,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C.

لجمع العينة، قم بإزالة العمود وقلبه داخل أنبوب نظيف ثم استخدم جهاز الطرد المركزي. افحص قيمة pH للعينة إذا لزم الأمر. قم بضبط القيمة لتكون بين pH 7 و8 باستخدام حمض الهيدروكلوريك بتركيز 1 molar.

أضف 5 µL من كاشف TMT لـ cyst وقم بتحضين التفاعل لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة، ثم اجمع العينات وأضف حجماً مساوياً من منظم Laly للعينة، ثم اغلي المزيج لمدة خمس دقائق وافصله باستخدام هلام بولي أكريلاميد مسبق الصب بتركيز 12%. بعد غسل الهلام ثلاث مرات بالماء المصفى، قم بتصبغ الهلام بصبغة Coomassie blue لمدة ساعة، ثم قم بإزالة الصبغة طوال الليل في الماء بناءً على تركيزات حزم البروتين. قسم كل مسار في الهلام إلى 12 جزءاً. قطّع كل جزء إلى قطع بحجم 1 mm وضعها في أنبوب سعة 1.5 mL.

اغمر قطع الهلام تماماً في محلول بيكربونات الأمونيوم بتركيز 0.1 molar في 50%aceto nitrile. ثم غطِ القطع بـ 100%aceto nitrile لمدة 15 دقيقة. تخلص من السائل وجفف القطع باستخدام جهاز speed vac.

بعد ذلك، أضف حجماً مساوياً من محلول tripsin وضعه على الثلج لإعادة الترطيب. ثم قم بالتحضين عند 37 degrees Celsius لمدة تتراوح من 12 إلى 16 ساعة لإتمام عملية هضم triptych. بعد ذلك، قم بإزالة مستخلص البروتين السائل من العينات التي تم تحضينها.

أوقف التفاعل وأزل أي هضم بروتيني متبقٍ عن طريق تغطية قطع الهلام بـ 5% formic acid و 50% aceto nitrile. ثم رج قطع الهلام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. انقل الطافي إلى أنابيب عينات البروتين المستخلصة بعد إجراء عمليتي استخلاص إضافيتين.

جفف العينات باستخدام جهاز التجفيف بالتفريغ والسرعة (speed vac) في أنابيب سعة 0.5 milliliter. حضّر ملاطاً بتركيز 50% من راتنج anti TMT في محلول TBS بتركيز يتناسب مع كثافة حزمة البروتين المعنية. اغسل الراتنج ثلاث مرات بحجم عمود واحد من محلول TBS بتركيز 1x، ثم أضف 200 microliters من محلول TBS إلى كل عينة.

ثم يتم النقل إلى راتنج anti TMT والرج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين، يليه التحريك التمايلي طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. يتم تحميل كل عينة على عمود، ثم تُجرى عمليات غسل للعمود بمقدار 200 µL لكل منها.

بعد ذلك، يتم شطف كل عينة ثلاث مرات باستخدام 200 µL من محلول الاستخلاص بتركيز 50%، ثم تُجفف تحت تفريغ هوائي. بعد ذلك، تُعلق العينات في 12 µL من الأسيتونيتريل بتركيز 3% مع 0.1% حمض الفورميك، ويُحقن 5 µL مباشرة في عمود HPLC. يتم استخلاص الببتيدات باستخدام تدرج متزايد من الأسيتونيتريل كما هو مفصل في النص المصاحب.

استخدم مطيافية الكتلة للكشف عن الببتيدات وفق سير عمل (top two by three). ابدأ بمرحلة واحدة من ms، ثم احصل على ثلاثة أطياف Ms.Ms باستخدام تكسير التفكك المحتجز في مصيدة الكوليزين بطاقة أعلى (higher energy C trapped dissociation fragmentation) متبوعة بثلاثة.

تقنية Ms.MS مع التفكيك المستحث بالتصادم لتحديد البروتينات. تحليل بيانات طيف الكتلة باستخدام سير عمل متفرع. تطبيق مقدر كمي للحديد المراسل لتقدير النسبة.

قم أيضًا بمعالجة طيف MSM MS من خلال عقد محدد الطيف وموحد الطيف ومجمع الطيف، ثم استعلم عن البيانات مقابل محرك البحث seaquest. تُظهر هذه الصورة أمثلة لورقة نبات طماطم ضابطة على اليسار وورقة محقونة ببكتيريا pseudomonas على اليمين بعد صبغ الأوراق باستخدام DAB. تتيح عملية صبغ DES أن يُظهر الصبغ الهستوكيميائي علامات لأنواع الأكسجين التفاعلية في أنسجة الورقة.

كما هو متوقع، لا تظهر عينة الضبط أي تلوين ملحوظ، بينما تظهر الأوراق المعالجة بـ pseudomonas تلوينًا إيجابيًا لإنتاج hydrogen peroxide. يوضح هذا المثال مخرجات بيانات اكتشاف البروتوم، حيث تتيح مساحة ذروة البروتين المنظم تفاضلياً بعملية الأكسدة والاختزال لكل عينة إجراء تقدير كمي مطلق. وتشير مساحة الذروة بين عينة الضبط والعينات الملقحة إلى الكميات النسبية.

هنا، يظهر أن التنظيم المختزل للمركب البروتيني بين العينة الضابطة والعينة الملقحة متشابه. وتشير القمم ذات الكثافة المتماثلة إلى وجود روابط ديسلفيد غير خاضعة للتنظيم بفعل التغيير في المعاملة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها بشكل صحيح خلال أسبوع واحد.

تذكر الحفاظ على العينات باردة وتنظيم الملصقات التعريفية. كما يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة عند استخدام الفينول، مثل ارتداء قفازات المختبر والعمل داخل خزانة استخلاص الغازات (Hood) وفقاً لهذا الإجراء. ويمكن إجراء تدابير أخرى، مثل تحليل طيف الكتلة النوعي للتعديلات ما بعد الترجمة، وذلك لتحديد تعديلات نظامية أخرى مثل حمض الأونيك ومحاكاة الغلوتين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ تمكين CTMD في وضع الاستعداد لـ DIB وتأهيل redox 16.