المكانية والزمانية التلاعب من نشاط GTPase الصغيرة على المستوى التحت خلوية وعلى المقياس الزمني من ثانية في الخلايا الحية

يوضح هذا الفيديو طريقة يتم من خلالها استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمعالجة نشاط البروتين في غشاء البلازما. للقيام بذلك ، يتم نقل الخلايا ببروتين FRB المثبت بالغشاء والبروتين المنصهر FK BP ذي الأهمية. تتم إضافة مشتق رابامايسين في قفص الصور إلى الوسط.

ثم أثناء تصوير الخلايا الحية ، يتم تطبيق ضوء الأشعة فوق البنفسجية على منطقة معينة من الخلية. يتم شق الرابط بين الرابامايسين والبيوتين ، مما يؤدي إلى إطلاق ثنائي الكيميائي ومنتجه الثانوي ، ينتشر ثنائي المزخرف الذي تم إطلاقه في الخلايا ، ويحفز الثنائي بين البروتين المسمى FKBP ذي الأهمية وغشاء البلازما المثبت FRB في المنطقة المشععة. بدون الأشعة فوق البنفسجية ، لا يرتبط FKBP و FRB ، وبالتالي لا ينتج عنه أي تأثير.

يكشف تحليل البيانات عن توظيف موضعي للغاية للبروتين المنصهر FKBP ذي الأهمية بناء على تأثيره الفسيولوجي. ميزة هذه التقنية على الأساليب الحالية مثل علم الأدوية ونهج علم الوراثة ، هي الجمع بين سرعة العمل وخصوصية الهدف والدقة المكانية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج السرطان النقيلي نتيجة لهجرة الخلايا السرطانية.

لذلك ، فإن التلاعب بنشاط عوامل الهجرة الرئيسية قد يكشف عن آليته الجزيئية الدقيقة ، وهو شرط أساسي لعلاجه وعلاجه. سيكون عرض الإجراء كريس بول ماير ، طالب دراسات عليا وبوب دي روز ، فني من مختبري. ابدأ هذا البروتوكول من خلال الجمع بين ما يلي في بلازميد أنبوب الطرد المركزي الدقيق المعقم ، والحمض النووي ، والغشاء المربوط FRB TAG الفلوري FKBP ، و TIA واحد والماء منزوع الأيونات ، إضافة ميكرولتر واحد ، وعدد قليل من الجينات HD إلى الخليط والدوامة.

احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. أثناء الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من بولي دي ليسين إلى كل بئر من جانب غرفة زجاجية مكونة من ثمانية آبار واحتضن لمدة دقيقة واحدة لتغطية السطح ، ثم استنشق المحلول واغسل وسط كل بئر ب 50 من الماء منزوع الأيونات. التربسين التالي هو 80 إلى 85٪ الملتقى المعاهد الوطنية للصحة ثلاث خلايا T ثلاثية.

بعد فصل الخلايا ، أضف 10 ملليلتر من DMEM الذي يحتوي على 10٪ FBS لنقل 375 ميكرولتر من المعلق إلى أنبوب معقم سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 1 ، 500 جم لمدة ثلاث دقائق. بعد الدوران ، استنشق الوسط بعناية. أضف 750 ميكرولتر من DMEM مع 10٪ FVS و Resus.

قم بتعليق الحبيبات عن طريق الماصة برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات. أخيرا ، أضف تعليق الخلية إلى محلول التعداء وباستخدام طرف الماصة ، وقم بتقليبه برفق ، أضف 250 ميكرولترا من تعليق تعداء الخلية إلى كل بئر من الغرفة. انزلق واحتضانه.

37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 18 ساعة. لتوليف قفص رابامايسين, البيوتين المقربة. ابدأ بإعداد محلول مخزون واحد مليمول من CRB في DMSO في أنبوب fuge معقم في أنبوب طرد مركزي صغير منفصل سعة 1.5 مليلتر لإذابة ملليغرام واحد من أفادون في 250 ميكرولتر من PBS.

بجانب اقتران الجزء من القفص إلى رابامايسين. أضف 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون CRB إلى AVID المذاب عن طريق الرجوع عدة مرات ثم احتضان درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. لإنتاج CRB AVID في محلول مترافق لاستبعاد الجزيئات الصغيرة غير المنضمة وتنقية CRBA ، قم بتوازن عمود استبعاد بحجم G 25 مع 300 ميكرولتر من PBS.

كرر خمس مرات بعد توازن العمود. قم بتحميل 125 ميكرولتر من محلول CRBA على السرير المركزي للعمود. ثم قم بتدوير المحلول لمدة دقيقتين عند 800 جم في درجة حرارة الغرفة ، اجمع التدفق في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر بعد تعداء الخلايا.

تبادل الوسيط إلى DMEM بدون FBS لتجويع الخلايا في الدم لمدة 12 ساعة. بعد الحضانة ، قم بشفط الوسط برفق وأضف 250 ميكرولتر من محلول CRBA المحضر. بجانب تصور ديناميكيات البروتين في الخلايا الحية ، استخدم مجهر ثنائي البؤر للقرص الدوار مع إضاءة الأشعة فوق البنفسجية لإقران البصريات لضوء LED للأشعة فوق البنفسجية عند 365 نانومتر.

مع ضوء التألق epi. حدد إحداثيات وحجم بقعة الإضاءة باستخدام صفيحة زجاجية مطلية بأصباغ الفلورسنت التي تثيرها الأشعة فوق البنفسجية. هذا يسمح بالضبط الدقيق للمنطقة المراد تعريضها للإشعاع.

ضع شريحة الغرفة مع الخلايا على المسرح باستخدام موضوعي 100 × مضان epi. اجعل الخلايا في بؤرة التركيز وابحث عن خلية. للتصوير ، ابدأ في تصوير الخلايا بعد تحديد مستويات خلفية التأثير الفسيولوجي.

هنا ، يتم قياس كشكشة الغشاء تشع ضوء الأشعة فوق البنفسجية في ربع واحد مختار من الخلية ، وإذابة غير مأهولة ، وبالتالي الرابامايسين الأصلي في DMSO ثم في PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 400 نانو مولار. أضف 100 ميكرولتر من المحلول إلى غرفة التصوير لإحداث تأثيرات عالمية. التقط صورا مضانية كل 15 ثانية لمدة 20 دقيقة لتحديد ما إذا كان التنشيط الموضعي ل RAC يمكن أن يحفز تكوين الكشكشة المحلية.

تم نقل ثلاث خلايا من المعاهد الوطنية للصحة باستخدام YFP الموسومة بمنشط RAC FK bp و TIA one و LDR ، وهو غشاء مثبت. الإشعاع الموضعي FRB على حافة الخلية المشار إليها بالدائرة الصفراء ، تبعه إضاءة عالمية بمصباح زئبقي لمدة ثانية واحدة تبدأ من 1063 ثانية. كما يتضح هنا ، لم يكن هناك أي تكشكشة غشائية تقريبا في البداية.

ومع ذلك ، بعد الإضاءة الموضعية ، لوحظ تكشكش محصور مكانيا بعد الإضاءة العالمية وإضافة الرابامايسين ، مما يتسبب في نقل FK bp TIA واحد إلى غشاء البلازما. أظهرت الخلية تكوين كشكشة عالمية مما يشير إلى أن تكوين الكشكشة المحلي الذي لوحظ سابقا كان ناتجا عن التنشيط المحصور مكانيا للرف. لإجراء تحليل كمي ، تم تقسيم الخلايا المستهدفة إلى أربعة أرباع وتم تحديد تواتر تكوين الكشكشة في كل ربع على التحفيز المحلي وكذلك التحفيز العالمي التالي كما هو موضح في هذا الرسم البياني.

لم تظهر أي من الخلايا المرصودة تكوين كشكشة مع CRBA بدون إشعاع أو أشعة موضعية ، إشعاع مع أو بدون عدن في وسط سائب. ومع ذلك ، عندما تمت إضافة CRBA وإجراء الأشعة فوق البنفسجية ، شوهد تكوين الكشكشة في نفس الشكل تقريبا ، ما يقرب من 90٪ في جميع الأرباع ذات الإشعاع العالمي عندما تم تشعيع الربع الأول فقط ، كان تواتر تكوين الكشكشة 100٪ مقارنة ب 30٪ 25٪ و 30٪ في الأرباع من اثنين إلى أربعة. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام فك الموضعي للرابامايسين لإحداث تأثيرات فسيولوجية موضعية للغاية في خلية واحدة.

في هذه الحالة ، يحدث تكشكشة الغشاء بسبب تنشيط الرف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحقيق التحكم الزمني المكاني لنشاط g TPAs الصغير عن طريق الضوء. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي عملية فسيولوجية تعتمد على بروتينات معينة تنتقل إلى غشاء البلازما.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحضير المحاليل والكواشف والخلايا حديثا لكل إجراء. لا تنس أن العمل مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما ارتداء الاحتياطات مثل نظارات الأشعة فوق البنفسجية.