الهندسة وتطور فيروس الغدة اسوشيتد الاصطناعية (AAV) المتجهات العلاج الجيني عن طريق الحمض النووي العائلة الخلط

يتمثل الهدف العام من التجربة التالية في إنشاء مكتبة متنوعة للغاية من كبسيدات الفيروسات المرتبطة بالغدية (aav) الاصطناعية، والتي يمكن من خلالها اختيار جزيئات ذات خصائص مرغوبة. ويتحقق ذلك أولاً عن طريق تكسير جينات كبسيدات aav المستنسخة والمختارة، ثم هضمها باستخدام إنزيمات قطع الحمض النووي (DNAse) بطريقة محكومة للسماح بإعادة تجميعها لاحقاً في تسلسلات خيمرية عبر تفاعلي PCR. وكخطوة ثانية، يتم استنساخ ناتج تفاعل PCR الناتج وإعادته إلى بنية aav قادرة على التضاعف لإنتاج مكتبة بلازميدات تضم على الأقل مليون جين مختلف لكبسيدات aav.

بعد ذلك، يتم ترانسفكشن مكتبة البلازميد هذه في خلايا 2 9 3 T، جنباً إلى جنب مع بلازميد مساعد للفيروس الغدي من أجل إنتاج مكتبة فيروسات خيمرية يمكن اختيارها لاحقاً على خلايا مستهدفة أو في الحيوانات. وتظهر النتائج النجاح في الهندسة الجزيئية وتطوير ناقلات A A V اصطناعية جديدة بناءً على تعبير جين مراسل معزز أو أكثر نوعية في الخلايا المستزرعة أو في الفئران البالغة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل عرض الببتيد في أن عملية تبديل عوائل DNA تمتلك القدرة على تغيير وتحسين ميزات متعددة لغلاف AV في آن واحد، بدءاً من الارتباط الخلوي والنقل داخل الخلايا وصولاً إلى إزالة الغلاف والتعبير الجيني في النواة.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات العلاج الجيني وعلم الفيروسات، مثل كيفية الحصول على ناقل مثالي لتطبيق علاجي معين أو كيفية تحليل نطاقات القفيصة الفيروسية المسؤولة عن خاصية محددة. وتمتد آثار هذه التقنية نحو علاج العديد من الأمراض البشرية، بما في ذلك الإصابة بمسببات الأمراض الفيروسية، لأن طريقتنا تسمح بالتطور الجزيئي لناقلات AAV التي تصيب الخلايا المستهدفة الفيروسية بشكل محدد وقوي، مثل الخلايا T لفيروس HIV أو الخلايا الكبدية لفيروسات التهاب الكبد. وبالرغم من ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة في بيولوجيا AAV ويمكن استخدامها لتحسين ناقلات AV للعلاج الجيني.

ويمكن أيضاً تطبيق هذه الطريقة بسهولة على عائلات جينية أخرى ذات أهمية أساسية أو تطبيقية، مثل تلك التي تشفر الفلورسنت، أو المراسلين الثلاثة، أو الإنزيمات الخلوية، أو البروتينات المشاركة في تداخل RNA. وقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نحاول إيجاد ناقل مناسب لنقل الجينات العلاجية إلى شرائح من الفئران البالغة، وأدركنا أن جميع الأنماط المصلية لـ AV الموجودة طبيعياً تعاني من عيوب، مثل الانتشار الواسع في البشر، وبالتالي ارتفاع معدل استجابة المناعة، أو ضعف الأداء in vivo رغم الكفاءة العالية في ترنسدكشن الخلايا الكبدية in vitro. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يصعب تعلم تجزئة جين قشرة AV القائم على DNA وبعض خطوات إنتاج المكتبة الفيروسية لأنها تتطلب خبرة وإدراكاً للمراحل الحرجة، وذلك لتسهيل التحضير الروتيني لكميات كافية من مختلف جينات قشرة الفيروسات المرتبطة بالغدد.

من أجل إعادة خلط الحمض النووي (DNA shuffling)، يتم في البداية استنساخ هذه الجينات في هيكل بلازميد مشترك. ولتحقيق ذلك، يتم أولاً تضخيم جينات cap المطلوبة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من بلازميدات AAV المتوفرة بشكل شائع باستخدام البادئات cap F وcap R. ثم تُستنسخ جينات cap في بلازميد مُهندس ليحتوي على مواقع ارتباط محددة للبادئات بالإضافة إلى مواقع قطع إنزيمية. في هذا المثال، يتم استنساخ جين cap في موقعي PAC one وASC one، واللذين يتواجدان في البادئات المستخدمة لتضخيم cap وفي البلازميد المستقبل، ولكنهما غائبان في معظم فيروسات AAV. عند تكوين مجموعات البلازميدات التي تشفر جينات قفيصة AAV، ابدأ إجراء إعادة خلط cap عن طريق PCR، من خلال تضخيم جينات cap المختارة باستخدام البادئات T3 وT7.

قم بإعداد تفاعل PCR بحجم 50 µL يحتوي على 200 ng من بلازميد cap، وكل بادئ بتركيز نهائي 2 µM، و10 µL من محلول high five buffer بتركيز five x، و1 µL من إنزيم high five polymerase. سينتج عن هذا التفاعل حوالي 3 µg من ناتج PCR، وهي كمية كافية لما يصل إلى ستة تفاعلات إعادة خلط (shuffling) بناءً على عدد جينات cap المراد تضمينها في المكتبة. ابدأ بـ 5 دقائق عند 95 °C، ثم قم بتشغيل 40 دورة تتكون من 15 ثانية عند 94 °C، و30 ثانية عند 57 °C، و3 دقائق عند 68 °C، تليها خطوة نهائية لمدة 10 دقائق عند 72 °C.

بعد تنقية نواتج الـ PCR، يُستخدم هضم متحكم فيه للحمض النووي DNA لإنشاء شظايا جين cap لإعادة تجميعها في Kyra. أحد أصعب جوانب هذا الإجراء هو الحصول على نطاق مفيد ومحدد من شظايا DNA المهضومة لجين cap لإعادة تجميعها في kyras؛ ولتحقيق هذا الهدف، نقوم بتجهيز كميات PLE من جينات cap المنقاة في البداية، ثم نجهز تفاعلات متوازية متعددة بظروف متغيرة. ولإعداد عملية الهضم بشكل متساوٍ، اخلط نواتج PCR المختلفة لجين cap لتصل الكمية الإجمالية إلى 4 µg في 54 µL من الماء، ثم أضف 6 µL من محلول درء التفاعل DS و 0.5 µL من DNAs 1 إلى التفاعل، ورُج الأنبوب بعناية ثلاث مرات، ثم قم بتدويره لفترة وجيزة وضعه فوراً على كتلة تسخين بدرجة حرارة 25 °C.

يُحضن هذا التفاعل الأول لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، يتم تحضير تفاعل هضم ثانٍ، ولكن يُحضن عند 25 درجة Celsius لمدة دقيقة واحدة و15 ثانية. وبهذه الطريقة، يتم إعداد تفاعلات متوازية متعددة بمدد تحضين تتراوح بين دقيقة ودقيقتين، مع تغيير مدة التحضين بزيادات قدرها 15 ثانية.

أوقف كل تفاعل بإضافة 6 µL من EDTA بتركيز 25 mM. قم برج الأنبوب لفترة وجيزة باستخدام جهاز vortext ثم حضنه لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 75 °C. ستؤدي التفاعلات المتوازية المتعددة إلى الحصول على خمس عينات من الـ cap مهضومة باستخدام DNAs، واحدة لأوقات تحضين مختلفة، ثم قم بتنقية قطع الـ cap باستخدام هلام AROS قياسي بنسبة 1%.

من الناحية المثالية، يجب أن تظهر مسحة (smear) مرئية تتراوح بين 100 و 500 base pairs كما هو موضح في هذا المثال، مع بدء فترات تحضين تبلغ دقيقة واحدة، أو 45 ثانية، أو دقيقتين. في عملية DNA family shuffling، يتم أولاً إعادة تجميع قطع الـ cap في تسلسلات كاملة الطول عبر PCR، حيث يتم تحضيرها ذاتياً بناءً على التماثلات الجزئية. قم بإعداد تفاعل بحجم 50 µL يحتوي على 500 ng من القطع المنقاة، و 10 µL من 10 x fusion buffer، و 1 µL من 10 mM dNTPs، و 1.5 µL من DMSO و 0.5 µL من fusion.

يتم تحضين البوليميراز لمدة 30 ثانية عند 98 درجة مئوية، ثم يتم إجراء 40 دورة تتكون من 10 ثوانٍ عند 98 درجة مئوية، و30 ثانية عند 42 درجة مئوية، و45 ثانية عند 72 درجة مئوية، تليها خطوة نهائية لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. بعد ذلك، يتم تضخيم جينات القبعة (cap genes) المُعاد تجميعها لغرض الاستنساخ اللاحق عن طريق تفاعل PCR ثانٍ باستخدام بادئات ترتبط بالتسلسلات الجانبية المحفوظة. على سبيل المثال، يتم إعداد تفاعل بحجم 50 µL باستخدام مجموعة SAF وSAR أو CUF وCUR، بحيث يحتوي التفاعل على 2 µL من ناتج تفاعل PCR الأول لكل بادئ بتركيز نهائي قدره 2 µM، و0.5 µL من كلوريد المغنيسيوم، و10 µL من محلول منظم high-FI بتركيز 5x، و1 µL من إنزيم high-FI polymerase.

يُنصح بإجراء من 16 إلى 24 تفاعل PCR لضمان الحصول على عوائد عالية بما يكفي لعملية الاستنساخ اللاحقة. بعد تجميع نواتج الـ PCR وتنقية حزمة الجين الكاملة، تتمثل الخطوة التالية في هضم مجموعة جينات cap المنقاة باستخدام PAC one و SC one من أجل الاستنساخ في بلازميد a a v قادر على التضاعف. يحمل البلازميد المستقبل تكرارات طرفية معكوسة a a v تحيط بجين AAV two rep تحت تحكم محفز AAV P five، و PAC one و ASC one.

تسمح مواقع التقييد الموجودة في اتجاه المصب من rep بالاستنساخ المتوافق مع إطار القراءة لمجموعة cap المبعثرة. وتعتبر مواقع ارتباط البادئ LSE الموضحة بالأسهم مفيدة لتسلسل جين cap، وتُدمج قطع cap والعمود الفقري للبلازميد المستقبل المقطوع بشكل مناسب بنسبة مولية تبلغ ثلاثة إلى واحد. يتم تحضير خليط رئيسي بحجم إجمالي قدره 40 µL يكفي لإجراء 20 عملية تحويل بتركيز نهائي للحمض النووي يبلغ 15 ng/µL.

يتم الحضن طوال الليل عند 16 درجة مئوية، وفي اليوم التالي، يتم تحويل ناتج تفاعل الربط إلى بكتيريا e coli. اخلط 2 µL من تفاعل الربط مع 30 µL من بكتيريا e coli المختصة كهربائياً، ثم انقل الخليط إلى كوفيتات التثقيب الكهربائي المبردة مسبقاً على الثلج، وقم بالتثقيب الكهربائي عند 1.8 kV و200 ohms و25 µF. يجب أن يكون الثابت الزمني قريباً من 5 ms، ثم أضف فوراً 1 mL من وسط SOC المدفأ مسبقاً، وانقله إلى دورق سعة 250 mL.

ستنتج 20 عملية تثقيب كهربائي كهذه مكتبة تتنوع بمقدار 1 × 10⁶ تقريباً من المستنسخات المختلفة. أضف حجماً واحداً من وسط SOC المُسخن مسبقاً إلى عمليات التحول المجمعة ورج المزيج عند درجة حرارة 37 °C وبسرعة 180 RPM لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، أضف 40 milliliters من عمليات التحول المجمعة إلى 800 milliliters من وسط lb مع إضافة الأمبيسيلين، واحضن المزيج لمدة 16 ساعة أخرى تحت نفس الظروف، ثم يتم تنقية DNA البلازميد الخاص بالمكتبة باستخدام طقم تجاري متاح.

تبدأ عملية إنتاج المكتبة الفيروسية بنقل جينات مكتبة a a v إلى خلايا HEC 2 9 3 T؛ لبدء هذا الإجراء، يتم استزراع خلايا HEC 2 9 3 T في 10 أطباق بمساحة 15 سنتيمتر مربع وتنميتها لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية. ولكل عملية نقل جينات، يتم تحضير خليطي الكواشف التاليين في أنبوبين منفصلين، والكميات المذكورة أدناه هي لكل 10 أطباق في الأنبوب الأول.

امزج 7.9 milliliters من كلوريد الصوديوم وDNA ثم أضف الماء ليصل الحجم الإجمالي إلى 15.8 milliliters. وفي الأنبوب الثاني، أضف 3.52 milliliters من بولي إيثيلين أمين، و7.9 milliliters من كلوريد الصوديوم، و4.38 milliliters من الماء. ادمج المزيجين معاً واستخدم جهاز الـ vortex ثم حضنهما لمدة 10 minutes في درجة حرارة الغرفة، ووزع المحلول بالتساوي على كل طبق من خلايا 2 9 3 T. ثم حضنها عند 37 degrees Celsius.

بعد مرور 48 ساعة، يمكن حصاد المكتبة الفيروسية. يتم كشط الخلايا في الوسط، وتجميع الخلايا من جميع الأطباق في أنبوب واحد، ثم إجراء عملية الطرد المركزي بسرعة 1200 RPM لمدة 15 دقيقة. تُعلق كُتلة الخلايا في ستة ملليلترات من منظم التحلل (lysis buffer)، ثم تُعرض لخمس دورات من التجميد والإذابة؛ وبعد انتهاء دورات التجميد والإذابة الخمس، تُحضن مع Ben Nase لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة Celsius.

بعد ذلك، قم بطرد بقايا الخلايا بسرعة 3,750 RPM لمدة 20 دقيقة. قم بإعداد تدرج لتنقية الفيروس باستخدام ماصة باست لإضافة خمسة ملي لتر من معلق الفيروس في أنبوب طرد مركزي Beckman Quicks seal، يليه 1.5 ملي لتر من كل من محلول iodal بتركيز 15% و25% و40%. أكمل التدرج باستخدام محلول التحلل (lysis buffer)، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي الفائق بسرعة 50,000 K لمدة ساعتين عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

عند الانتهاء من عملية الطرد المركزي الفائق، أخرج الأنبوب من الدوار ونظف الجزء الخارجي من الأنبوب باستخدام 70% ethanol. اغرس إبرة في الجزء العلوي من الأنبوب للتهوية، واستخدم إبرة أخرى لسحب 1.2 milliliters من جزء 40% IOL. احرص على تجنب السحب من جزء 25% لأنه يحتوي على فراغات.

قشور AAV. يتم تحليل المستنسخات الفردية من مكتبة البلازميد الأصلية للتحقق من وظائفها وتنوعها عن طريق استخدامها لإنتاج ناقلات AAV تعبر عن جين مراسل. بعد ذلك، يتم إصابة الخلايا المستزرعة أو الحيوانات بكميات مختلفة من الفيروس المنقى، ومن ثم يتم تحديد كفاءة ترانسدكشن.

تظهر هنا نتائج المجهر الفلوري لثلاثة خطوط خلايا بشرية مصابة بخمسة ناقلات AAV مختلفة تعبر عن YFP معاد تركيبها ومصنعة باستخدام جينات قبعة (cap genes) مبعثرة. وهناك طريقة بديلة لتحليل كفاءة ترانسدكشن (transduction efficiency) وهي القياس القائم على تقنية FACS للتعبير عن الجين المراسل الفلوري. يوضح هذا الشكل نتيجة نموذجية لأربعة أنواع من الخلايا: الكلى البشرية، وعنق الرحم البشري، والأرومات الليفية الفأرية، والخلايا التائية البشرية، المصابة بـ 18 ناقلاً مختلفاً من AAV تعبر عن YFP معاد تركيبها ومصنعة باستخدام جينات قبعة مبعثرة تم اختيارها عشوائياً من مكتبة أصلية.

تم ترميز تعبير YFP بالألوان لتسهيل الرؤية. توضح الصور الموضحة النسب المئوية للخلايا المتحولة، حيث يشير اللون الأسود إلى 0% ويشير اللون الأبيض إلى أعلى عدد تم قياسه في كل نوع من أنواع الخلايا. يمثل Clone B 2 باللون الأحمر مثالاً لنسيلة ذات فعالية إجمالية ضعيفة، كما هو متوقع من الكابسيدات غير المختارة. يمكن بعد ذلك فحص المكتبة الفيروسية للبحث عن جزيئات مفردة تظهر معظم أو كل الخصائص المطلوبة في سلالة خلوية معينة أو في الحيوانات لأغراض الاختيار.

في الخلايا المستنبتة، يتم أولاً إصابة الخلايا بالعدوى المشتركة باستخدام حصص مختلفة من المكتبة وفيروس ENO five لدعم نمو a a v، ثم يتم حصاد الخلايا واستخلاص a a v المُضخم واستخدامه لإعادة إصابة خلايا جديدة. ويعد تحديد نسب a a v adenovirus المثلى للإصابة المشتركة للخلايا أمراً مهماً، كما أن المقياس الجيد لعدوى arius القوية هو حدوث التأثيرات المرضية الخلوية بعد ثلاثة أيام من تلقيح الفيروس، وهو ما يتضح من خلال استدارة الخلايا وانفصالها؛ وفي هذا الشكل، تظهر اللوحة العلوية اليسرى خلايا غير مصابة، بينما تظهر اللوحات الأخرى خلايا مصابة بالكميات المحددة من adenovirus مقاسةً بعدد الجزيئات لكل خلية. وهناك مؤشر مفيد آخر لإصابة a a v وتضخيمها وهو الكشف عن بروتينات القفيصة بواسطة لطخة ويسترن باستخدام الجسم المضاد B one الذي يتعرف على حاتمة قفيصة a a v المحفوظة للغاية.

تظهر اللطخة الموجودة على اليسار خلايا مصابة مشتركة بأحجام مختلفة بالميكرولتر من مكتبة a a V وفيروس ENO المساعد. يمثل المساران الأولان أمثلة جيدة للظروف التي تعطي تعبيراً بروتينياً لـ a a v بالكاد يمكن اكتشافه، مما يشير إلى عدوى وتضخيم لـ a a v كافيين ولكن دون إفراط، وبالتالي تحقيق الارتباط الوثيق المطلوب بين النمط الجيني والنمط الظاهري. وبناءً على ذلك، تم استخدام 0.11 أو 10 microliters من هذه السوائل الطافية لإعادة إصابة خلايا جديدة.

تظهر نتائج لطخة ويسترن في الخلايا الموجودة على اليمين. في LA c، تم الإصابة بـ a v وحده كمجموعة ضابطة سلبية. ومن الضروري أيضاً مراقبة تنوع المكتبة خلال جولات الإصابة المتكررة عن طريق تسلسل الحمض النووي DNA sequencing.

يوضح هذا المخطط مقارنات لتسلسلات البروتين لنسخ AAV من مكتبة تعتمد على AAV two وeight وnine قبل وبعد الاختيار؛ حيث تظهر التسلسلات الموجودة فوق الخط الأحمر AAVs الأصلية. وتشير الأسهم الأرجوانية إلى أحداث إعادة التركيب المتماثل. بينما يشير السهم الأحمر إلى نقطة عبور (crossover) بين AAV two وAAV nine لوحظت في جميع النسخ المختارة. وبالنسبة للاختيار في الحيوانات، يتم حقن مكتبة a a V في الحيوانات، ثم تُستعاد من الخلايا أو الأنسجة المستهدفة بواسطة PCR، وبعد ذلك يتم استنساخها وإعادة تعبئتها لجولة عدوى جديدة.

يظهر هنا مثال على استعادة ناجحة لمستنسخات AAV مصابة من أكباد الفئران بعد أسبوع واحد من حقن المكتبة الطرفية. يوضح المسار الأول الحزمة المتوقعة بحجم 2.2 kilobase، بينما يمثل المسار الثاني ضابطاً خالياً من القالب. أحجام حزم مؤشر DNA في المسار M مشار إليها بـ kilobases. وبصرف النظر عن إجراء الاختيار، يجب في النهاية التحقق من صحة متغيرات الكبسيدة المثرى في أنظمة مناسبة.

يظهر هنا مثال على الأداء المتفوق لناقل AAV kymera في الخلايا المستنبتة. تشير الألوان الداكنة إلى قدرة أعلى على العدوى لكل جسيم، وبالتالي لكل سلالة. يتفوق AAV-DJ على مجموعة من ثمانية أنواع برية طبيعية من AAV في نطاق واسع من الخطوط الخلوية.

أخيرًا، يظهر تحليل لنسيلة مختارة من AAV KYMERA في كبد الفئران. تم اختيار AAV DN بناءً على خلايا سرطان الكبد المرآتية، ثم استُخدمت لإنتاج ناقلات مؤتلفة تعبر عن luciferase، كما هو موضح في الفئران الممثلة (ثلاثة في كل مجموعة) بعد أسبوع واحد من التسريب المحيطي بجرعات متساوية من هذا الناقل أو بمجموعة ضابطة تعتمد على wild type AAV8، وهو أحد أقوى العزلات الطبيعية المعروفة في كبد الفئران. لاحظ أنه بينما تعطي نسيلة AAV DN تعبيرًا إجماليًا أقل قليلاً في الكبد، إلا أنها أكثر تخصصًا لهذا العضو لأنها تظهر استهدافًا خارج النطاق أقل بكثير في الأنسجة غير الكبدية بمجرد ضبط مستويات التعبير في الكبد عبر برنامج التصوير بعد المعالجة.

يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون أسبوع واحد، بدءاً من تضخيم جينات القفيصة لـ a a V وانتهاءً بالمكتبة الفيروسية إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وعند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن البروتوكول المقدم هنا مستمد من خبراتنا في اختيار الأنماط المصلية الطبيعية لـ AV، ومن الممكن جداً أن تحتاج بعض الظروف إلى التعديل والضبط الدقيق عندما يقوم مستخدمون آخرون بإنشاء مكتباتهم المخصصة. وإلى جانب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عرض الببتيد الموجه للموقع باستخدام AGENESIS أو العشوائية القائمة على PCR لإنشاء مكتبات عالية التنوع أيضاً، أو لمحاولة تحسين خصائص القفيصات التي تم إنشاؤها وإثراؤها باستخدام إعادة خلط عائلة DNA بعد تطويرها.

لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال توصيل الجينات الفيروسية لاستكشاف استراتيجيات علاجية للأمراض والخلايا المستهدفة ذات الصلة التي لم تقدم فيها أنواع AAV التقليدية نتائج مرضية، مثل عدوى HIV والخلايا T، بالإضافة إلى استكشاف نقل الجينات القائم على الناقلات إلى الخلايا الجذعية البشرية وغيرها من الخلايا الصعبة الإصابة في المزارع الخلوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية هندسة وتطوير مكتبات متنوعة للغاية من ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدد السندية الاصطناعية باستخدام مزيج من تجزئة الجينات وإعادة تجميعها، وكذلك كيفية اختيار هذه المكتبات بشكل أساسي في الخلايا المستزرعة أو في الحيوانات من أجل إثراء كبسيدات فردية بخصائص محددة مرغوبة لاستخدامها كناقلات لنقل الجينات. لا تنسَ أن العمل مع الفيروسات الغدانية قد يكون خطيراً، ويجب اتخاذ العديد من الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.