والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

يهدف هذا التجربة إلى توضيح كيفية استخدام نظام زراعة الخلايا العصبية الأولية لدراسة كمون فيروس الهربس البسيط وإعادة تنشيطه. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل عصبونات العقد الرقبية العلوية من أجنة RA، ثم زراعة العصبونات المعزولة من العقد المفككة بعد التخلص من الخلايا غير العصبية. كما يتم إحداث عدوى كامنة بفيروس HSV باستخدام فيروس EGFP لإصابة العصبونات في وجود مثبط للتضاعف الانحلالي.

تتمثل الخطوة التالية في تحفيز إعادة تنشيط المزارع المصابة الكامنة. وأخيراً، يتم تقييم كفاءة إعادة التنشيط من خلال مراقبة تعبير EGFP بمرور الوقت. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح كيف تقوم مسارات الإشارات العصبية المختلفة بتنظيم كمون فيروس herpes simplex وإعادة تنشيطه من خلال استخدام المثبطات الكيميائية، وتداخل RNA، ونقل الجينات.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أنها تسمح بإجراء دراسات تفصيلية للتفاعلات التي تنظم كمون فيروس الهربس البسيط في عصبون المضيف على المستوى الجزيئي. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال كمون فيروس الهربس البسيط، مثل ما هي الإشارات التي تعمل على كبح الجينوم الكامن وكيف يتم تحفيز إعادة التنشيط على المستوى الجزيئي؟ وفي العصبونات، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية معمقة حول كمون HSV one.

يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على فيروسات أخرى من عائلة فيروسات الهربس ألفا ذات الخصائص الموجهة للأعصاب. سيقوم ماريجو وكوتشي وجوليان كيم، وجميعهم طلاب دراسات عليا في مختبراتنا، بتوضيح الإجراء. يتم عزل عصبونات العقد العنقية العلوية أو SCG لهذا البروتوكول من جراء الجرذان في اليوم الجنيني E 21 التي تم إخراجها من رحم أنثى جرذ حامل. أثناء العمل على غطاء التشريح، يتم التضحية بكل جرو عن طريق توجيه المقص إلى قاعدة الرقبة فوق الكتفين مباشرة وفصل الرأس عن الجذع. ولكشف العقد، استخدم إبراً من عيار 23 لتثبيت الرأس في ثلاثة مواقع بحيث تكون جهة الرقبة للأعلى.

أولاً، قم بتثبيت الحبل الشوكي. ثانياً، اسحب الجلد الأمامي فوق الأنف وقم بتثبيته، وثالثاً قم بتثبيت المريء والرغامي بعيداً عن الجزء الخلفي من الرقبة. ابحث عن العقدة الرقبية العلوية (SCG) من خلال تحديد موقع تفرع الشريان السباتي.

الشريان السباتي هو بنية مزدوجة. توجد تشعبات اثنتان على جانبي الرقبة، وبالتالي هناك عقدتان عصبيتان سباتيتان علويتان (SCG) لكل فرد. تقع الـ SCG مباشرة تحت الفرع.

افصل العقدة العقديةsuperior cervical ganglion (SCG) عن الشرايين عن طريق سحب التفرع متباعداً باستخدام الطرفين. تكون SCG شفافة وعديمة اللون مقارنة بالأنسجة الدهنية الصفراء المعتمة التي تحيط بالتفرع. ضع العقد في 12 milliliters من L 15.

وسط مغذٍ مضاف إليه الجلوكوز في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter على الثلج. بعد حصاد جميع الـ SCGs من الأجنة وسحبها برفق، يتم طرد العقد مركزياً لمدة دقيقة واحدة عند 600 RPM، ثم يتم إزالة الوسط الزائد.

قم بتعليق العقد في 1 mL من وسط L 15 الذي يحتوي على التريبسين والكولاجيناز. قم بالتحضين لمدة 24 دقيقة عند 37 °C.

قم بالرج كل ثماني دقائق. بعد ذلك، أضف 10 milliliters من الوسط البحري لإبطال مفعول التريبسين عبر الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة. وبسرعة 600 RPM، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من وسط التريبسين والكولاجيناز، واغسل العقد العصبية بـ 10 milliliters من الوسط C باستخدام الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 600 RPM.

كرر عملية الغسل هذه مرة واحدة. قم بإزالة وسط الغسل وأعد تعليق العقد في 1 mL من وسط C لتفكيكها عن طريق التفتيت باستخدام إبرة قياس 21 G متصلة بمحقنة سعة 5 mL لمدة أقصاها 15 دورة من السحب والدفع. أكمل عملية التفتيت باستخدام إبرة قياس 23 G حتى تتفكك غالبية التكتلات.

قم بإزالة أي تكتلات خلوية متبقية عن طريق ترشيح العصبونات المفككة عبر مرشح نايلون بمقاس 70 micron في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. اسحب عينة قدرها 10 microliter من معلق الخلايا المرشح، ومزيج من triam blue لتحديد عدد الخلايا الحية. قم بعدّ الخلايا التي تستبعد الصبغة بنشاط باستخدام hemo cytometer.

بعد ذلك، قم بتوزيع ما بين 5,000 إلى 6,000 من إجمالي الخلايا الحية في 100 µL من الوسط C في كل بئر من طبق زراعة أنسجة ذي 96 بئراً مطلياً مسبقاً بالكولاجين واللامينين، مع تضمين 50 ng/mL من عامل نمو الأعصاب في الوسط C. يتم التحضين طوال الليل عند درجة حرارة 37 °C، وفي اليوم التالي، وهو اليوم الأول في المختبر أو DIV 1، يتم التحقق من الالتصاق السليم للخلايا العصبية ونمو بعض البروزات المحورية.

استبدل الوسط C في الآبار بـ 50 µL من الوسط العصبي الأساسي (neuro basal medium) أو NBM المحتوي على NGF Acho و 5-fluoro-2-deoxyuridine. استبدل الأوساط صفاً تلو الآخر لضمان عدم جفاف الخلايا. ثم حضّن المزارع عند درجة حرارة 37 °C لمدة خمسة أيام.

راقب المزرعة يومياً للتأكد من موت الخلايا غير العصبية ونمو الخلايا العصبية. لبدء هذا الجزء من الإجراء في اليوم السادس من الزراعة المختبرية (day in vitro six)، تحقق من القضاء على غالبية الخلايا الداعمة غير العصبية. من الأهمية بمكان تقليل المناولة الفيزيائية غير الضرورية للخلايا العصبية في جميع الأوقات.

يجب إجراء عملية إزالة الوسط واستبداله برفق شديد وببطء، وإلا فإن الإجهاد الميكانيكي الناتج قد يؤثر على حيوية العصبونات. أضف aciclovir أو CV إلى الوسط الموجود في كل بئر ليصل إلى تركيز نهائي قدره 100 micromolar. أضف CV ببطء ورفق لضمان عدم تأثير القوة الميكانيكية سلباً على الخلايا في اليوم التالي.

في اليوم السابع من الزراعة (DIV seven)، يتم إصابة مستنبتات SCG بفيروس HSV 1 معاد التركيب يعبر عن مراسل EGF مدمج مع البروتين الحلولي الفيروسي US 11، وبمضاعفة عدوى تتراوح بين 1 إلى 2. أضف الفيروس المخفف مباشرة إلى الوسط الموجود في البئر. تضمنت التجربة مجموعة ضابطة مصابة وهمياً ومجموعة إصابة حلولية.

ضابط موجب في أوساط تفتقر إلى CV. اترك العدوى تستمر لمدة تتراوح من ساعتين إلى ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك، استبدل أوساط العدوى بـ NBM طازج يحتوي على NGF وCV. من الضروري توخي الحذر الشديد عند تغيير أوساط العدوى؛ أمل الطبق نحوك وأزل الأوساط ببطء من قاع البئر.

بعد ذلك، وجّه طرف الماصة نحو جدار البئر بدلاً من قاعه، واترك الوسط ينزلق برفق فوق الخلايا. استبدل الوسط في صف واحد في كل مرة لتجنب جفاف الخلايا. أعِد المزارع إلى الحاضنة، مع التعامل معها بأكبر قدر ممكن من الرفق لتجنب إضعاف قدرتها على دعم كمون HSV one.

يتم الحفاظ على المزارع لمدة ستة أيام عند 37 درجة مئوية، وهي الفترة التي سيثبت خلالها الفيروس حالة الكمون. خلال هذه الفترة، يُستخدم المجهر الفلوري لمراقبة تعبير us 11 EGFP كمؤشر على التضاعف التحليلي.

كما هو متوقع، لا ينبغي أن يكون هناك تعبير لبروتين GFP في مجموعة التحكم المصابة وهمياً. يجب الكشف عن S 11 EGFP في العينات المصابة فقط. أما آبار التحكم الموجبة التي تفتقر إلى المعالجة بـ CV فتشير إلى نجاح العدوى الأولية والتضاعف التحللي المنتج.

لتقييم إعادة التنشيط في اليوم 14 من الزرع (DIV 14)، استبدل بعناية الوسط الذي يحتوي على CV بوسط طازج يخلو من CV كما سبق. وجه طرف الماصة نحو جدار البئر بدلاً من قاعه، واسمح للوسط بالانزلاق بلطف فوق الخلايا إذا كان ذلك مناسباً. أضف المتغيرات الفارماكولوجية أو البيولوجية مثل LY 2 9 0 0 4 بتركيز 20 micromolar.

لا ينبغي اكتشاف أي تعبير لبروتين GFP في المزارع المصابة كامناً والمعالجة بـ A CV. تُعاد الخلايا إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية على مدى فترة تتراوح من خمسة إلى ستة أيام. يتم مراقبة المزارع الحية باستخدام مجهر فلوري للكشف عن العصبونات التي تمر بمرحلة إعادة التنشيط.

يتم حساب تردد إعادة التنشيط عن طريق عد عدد الآبار التي تحتوي على عصبونات موجبة لـ EGFP والتعبير عن ذلك كنسبة من العدد الإجمالي لآبار العينة. يوضح هذا الشكل مثالاً حيث يتم تطبيق trigger statin، وهو محفز معروف لإعادة التنشيط، على مستنبتات العقد الشوكية الخلفية (SCG) المصابة في مرحلة متأخرة. تمت مراقبة إعادة التنشيط وتقييمها باستخدام المجهر الفلوري كل يوم بعد العلاج الدوائي لمدة خمسة أيام.

مع استخدام TSA، يصل إعادة التنشيط إلى 50% من الحد الأقصى في غضون يومين، وبحلول اليوم الخامس، يصل إعادة التنشيط إلى 60%. يُمثَّل خط الأساس أو إعادة التنشيط التلقائي بواسطة DMSO. بلغت نسبة المزارع الضابطة المعالجة في هذه التجربة 10% تقريباً، وتتراوح عادةً من 5% إلى 20% باستخدام هذا النظام في المختبر (in vitro). كما عولجت مزارع SCG المصابة في مرحلة متأخرة بـ LY 2 9 0 0 4.

تمت مقارنة مزارع إعادة التنشيط التي تم تحفيزها بواسطة LY، وهو محفز معروف لإعادة التنشيط، مع المزارع المعالجة بمثبط تخليق الحمض النووي الفيروسي، phospho، no acetic acid، والمركبين معاً كما هو موضح هنا، حيث يضعف PAA من تعبير US 11 EGFP في المزارع التي تم تحفيزها لإعادة التنشيط بواسطة LY 2 9 4 0 0 2، مما يشير إلى أن تعبير US 11 EGFP يعتمد على تضاعف الحمض النووي الفيروسي. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم إيلاء اهتمام وثيق للتقنية المعقمة والتعامل مع مزرعة CG بأكبر قدر ممكن من الرفق لتجنب زيادة إعادة التنشيط التلقائية الناجمة عن الإجهاد أو الحركات الميكانيكية. بعد اتباع هذا الإجراء لإنشاء عدوى HSV one كامنة في العصبونات المستزرعة، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل S-H-R-N-A، والتعطيل الجيني (knockdown)، والتعبير الخارجي للجين البري والجين الطافر، وذلك من أجل توصيف الوظائف العصبونية التي تنظم كمون HSV one وإعادة تنشيطه.

لا تنسَ أن فيروس HSV-1 هو ممرض بشري يتطلب احتياطات السلامة من المستوى الحيوي الثاني (PSL 2). يجب أن تكون مُلمّاً بالعمل وفق شروط المستوى الحيوي الثاني قبل تنفيذ هذا الإجراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مستنبتات SCG لإحداث عدوى HSV-1 الكامنة، وكيفية تحفيز إعادة التنشيط بشكل فعال في الخلايا العصبية.