المستمدة زراعة والتطبيقات تناوب الحائط تفاعلات الاحيائية سفينة 3D نماذج الخلايا الظهارية

يقدم هذا البروتوكول غير التقليدي نظاماً سهلاً وقوياً لاستزراع الخلايا الظهارية البشرية في نماذج ثلاثية الأبعاد ذات بنية عضوية تحاكي الأنسجة البشرية في الجسم الحي. أولاً، يتم استزراع الخلايا الظهارية حتى تصل إلى مرحلة الطبقة الأحادية المتلاحمة في قارورة استزراع الأنسجة ثم يتم حصادها، وبعد ذلك تُدمج مع حبيبات الحوامل الدقيقة في مفاعل STLV الحيوي؛ حيث يتم تدوير STLV على المنصة لإيجاد بيئة سقوط حر مستمرة ذات قص سائل منخفض، مما يسمح للخلايا بالالتصاق والنمو على الحبيبات وتكوين تجمعات خلوية بعد 96 ساعة وتقريباً كل يوم بعد ذلك.

قم بتجديد الوسط الغذائي في الـ SDLV لتعويض الاستهلاك الناتج عن التمثيل الغذائي الخلوي عند تكوين التجمعات، وقم بتصوير عينات التجمعات باستخدام المجهر الضوئي أسبوعياً لمراقبة التقدم التطوري بمجرد اكتمال تكوين التجمعات والتمايز الخلوي. ثم ازرع التجمعات لإجراء التحاليل والمقايسات التجريبية اللاحقة. وفي النهاية، يمكن لهذا النظام توليد أنظمة نماذج عضوية مشابهة للظروف الحيوية (in vivo) للعديد من الاستقصاءات العلمية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الزراعة الخلوية التقليدية، في أن الخلايا الظهارية ستتمايز وتستقطب إلى تجمعات شبيهة بالأنسجة، وبالتالي تسلك سلوكاً مشابهاً للأنسجة البشرية الحقيقية من الناحيتين المورفولوجية والوظيفية. ويوفر نظام النموذج ثلاثي الأبعاد هذا رؤية أعمق في بيولوجيا الخلايا الظهارية، والتفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض، والتفاعل المعقد بين أنواع الخلايا التي قد يتم إدخالها في النظام. د. أندريا رادكي.

سيقوم الآن باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري بتوضيح هذا الإجراء لإزالة السمية من المفاعل الحيوي للأوعية الجانبية بطيء الدوران. قم بتغطية المنافذ المفتوحة باستخدام أغطية لور (lure caps). املأ STLV بـ 95% ethanol واتركه للاتزان لمدة 24 ساعة.

قم بإزالة الإيثانول، ثم املأ الجهاز بماء مقطر معقم وحضنه لمدة 24 ساعة باستخدام الأدوات المقدمة من المورد، وقم بفك جميع البراغي وإزالة السدادة المركزية من STLV. ضعها في كيس تعقيم وعقمها في الموصدة (autoclave) عند 110 degrees Celsius لمدة 20 دقيقة. أعد تجميع STLV وكرر عملية إزالة السموم لضمان التعقيم.

بعد ذلك، أحكم ربط براغي الـ STLV. قم بتوصيل صنبور إيقاف أحادي الاتجاه معقم مسبقاً بكل منفذ. والآن، قم بإزالة المكبسات من سرنجات Luer lock سعة 10 ملليلتر وخمسة ملليلتر، واحفظ المكبسات في أغلفتاها.

للحفاظ على التعقيم، قم بربط المحاقن بصنبور الإيقاف. ابدأ بإضافة DPBS إلى المحقنة سعة 10 milliliter حتى يمتلئ STLV وتبدأ المحقنة سعة five milliliter في الامتلاء. بعد ذلك، أعد تركيب المكبسات المعقمة في كل محقنة، وقم بإزالة أي فقاعات متبقية في المفاعل الحيوي عن طريق التناوب بين دفع مكبسات المحاقن.

أغلق صمامات التوقف وثبّت جهاز STLV على المنصة الرأسية الدوارة. قم بالتدوير لمدة 24 ساعة كحد أدنى لمراقبة وجود أي تسريبات في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. أضف 15 milliliters من DPBS إلى 250 milligrams من حبيبات cyto dex microcar ثم قم بالتعقيم بالأتوكلاف بعد التبريد.

قم بإزالة غسول DPBS ثلاث مرات باستخدام وسط زراعة الخلايا الظهارية. قم بتدوير الأنبوب لإعادة تعليق الخرزات. ثم أعد تعليق الخرزات في 15 milliliters من وسط الزراعة.

أولاً، يتم استزراع 1×10⁷ من الخلايا الطلائية كطبقات أحادية في دوارق زراعة الأنسجة. يتم حصاد الخلايا ثم عدّها وتحديد حيويتها عن طريق صبغ الاستبعاد بصبغة تريبان الزرقاء، وبعد ذلك تُضاف الخلايا إلى الخرز المُجهّز.

اشطف الأنبوب المخروطي لضمان نقل جميع الخلايا. بعد ذلك، قم بإزالة DPBS والمحاقن من STLV. كما يجب إزالة السدادة من المنفذ المركزي باستخدام ماصة سيرولوجية سعة 10 milliliter.

قم بتحميل معلق خرز الخلايا الظهارية في جهاز STLV. اشطف الأنبوب المخروطي مرة واحدة لنقل جميع الخلايا والخرز. ثم أعد تركيب سدادة المنفذ المركزي.

بعد ذلك، قم بإزالة المكابس من محقنة سعة 5 mL وأخرى سعة 10 mL وضع المكابس في أغلفتهما. وللحفاظ على التعقيم، قم بربط فتحات المحقنة بصنابير إيقاف مفتوحة. املأ الـ STLV بالوسط الزرعي.

استبدل المكبسات وأغلق الصمام. الآن، قم بموازنة مزرعة STLV التي تم استزراعها حديثاً في حاضنة عند درجة حرارة 37 degree Celsius لمدة 30 minutes بدون تدوير. بعد إخراج STLV من الحاضنة، افتح الصمام.

قم بإزالة أي فقاعات باستخدام المكبس ثم أغلق صمام الإيقاف. بعد ذلك، اضبط جهاز STLV على الدوران المستمر بسرعة 20 RPM داخل الحاضنة. بعد مرور 96 إلى 120 ساعة، قم بتغيير الوسط الغذائي عن طريق إزالة المحاقن وفتح صمامي الإيقاف في جهاز STLV للسماح للخرز والخلايا بالترسب.

بمجرد استقرار الخلايا، قم بسحب حوالي 75% من الوسط الزرعي من المنفذ الجانبي باستخدام المحاقن لتنفيذ بروتوكول التغذية. ومرة أخرى، استمر في تعويض الوسط الزرعي حسب الحاجة بناءً على عملية التمثيل الغذائي الخلوي. كما يجب مراقبة نمو وحيوية التجمعات الخلوية كل خمسة إلى سبعة أيام.

لتجنب تكسر التجمعات، استخدم رأس ماصة سعة 1000 ميكرولتر تم قص حوالي سنتيمترين من طرفه وتعقيمه. قم بإزالة 200 ميكرولتر من التجمعات بعناية من المنفذ المركزي ووزعها في أنبوبين سعة 1.5 مليلتر. استخدم إحدى العينات لمراقبة الحيوية الخلوية. بعد فصل الخلايا عن الخرزات، قم بتقييم الحيوية عن طريق استبعاد صبغة trypan blue.

التصبيغ لتصوير التجمعات الخلوية. أضف من 0.5 إلى 1 مل من الوسط الغذائي إلى الجزء الثاني من عينة التجمعات بحجم 1.5 مل، وانقله إلى طبق بتري صغير باستخدام طرف ماصة 1000 µL مقطوع الطرف لتصوير التجمعات.

عند استخدام مجهر ضوئي مقلوب لبعض نماذج الخلايا الظهارية، يكون من الضروري نقل التجمعات إلى وعاء قابل للتخلص منه لزيادة تهوية المزرعة قبل أسبوع واحد تقريبًا من حصاد التجمعات. ولإجراء التحليل، قم بإزالة المحاقن من STLV وصب حوالي 50% من الوسط من المنفذ الجانبي. ثم قم بإزالة السدادة المركزية وصب جميع المحتويات بعناية في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter من المنفذ المركزي.

اشطف الـ STLV مرتين باستخدام خمسة مليلتر من الوسط الغذائي واجمع نواتج الشطف مع التجمعات التي تم حصادها. بعد ذلك، انقل التجمعات من الأنبوب المخروطي سعة 50 مليلتر إلى الـ Harv. بعد مرور أسبوع واحد، احصد التجمعات بعناية لاستخدامها في تنسيقات المقايسة المحتملة والمقايسات والتحليلات؛ حيث تم تنمية تجمعات ظهارية بشرية متمايزة في نظام المفاعل الحيوي STLV.

تم جمع صور المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) من خلايا مهبلية بشرية تم إنماؤها في STLV لمدة 39 يوماً. يلاحظ أن التجمعات ثلاثية الأبعاد تظهر سمات تركيبية فائقة مشابهة للأنسجة، وهي الثنيات الدقيقة، والانغمازات، والحويصلات الإفرازية داخل الخلايا، والخملات الدقيقة على السطح القمي. وتشير صور مجهر الفلورة المناعية البؤري للخلايا المهبلية ثلاثية الأبعاد إلى تعبير عن الميوسين وعلامات محددة للخلايا الظهارية والتمايز النهائي. كما تعمل الأنماط الظاهرية ذات الصلة فسيولوجياً كمنصة ممتازة لتقييم سمية المركبات.

يمكن استخدام مقايسة MTT، وهي مقايسة شائعة الاستخدام لقياس حيوية الخلايا أو التمثيل الغذائي أو التكاثر، لقياس السُمية تجاه مختلف المواد الكيميائية والمركبات. وبدلاً من ذلك، يمكن قياس السُمية بعد المعالجة بالمركبات المختبرة عن طريق استبعاد صبغة tripan blue. في هذا المثال، بعد المعالجة بمركب NONOXINOL nine، أظهرت التجمعات المهبلية استجابة سُمية مشابهة لتلك الموجودة في نماذج cervical X explan، ولكن بملف تعريف مختلف مقارنة بالطبقات الأحادية.

تتميز التجمعات ثلاثية الأبعاد بكونها مستجيبة وظيفياً، على سبيل المثال، عند تحفيزها بجزيئات مشتقة من الميكروبات التي تتعرف عليها المستقبلات الشبيهة بـ toll. تستجيب هذه التجمعات وتفرز السيتوكينات المحفزة للالتهابات، بما في ذلك بروتين IL six والتعبير النسخي لمستقبل البروجسترون. كما يمكن ملاحظة وجود مستقبل يستجيب للتحفيز الهرموني في الخلايا المهبلية.

لا تمتلك التجمعات ثلاثية الأبعاد القدرة على الاستجابة لجزيئات المسببات المرضية والهرمونات فحسب، بل إنها قادرة أيضاً على دعم عدوى فيروس الهربس البسيط من النوع الثاني وظيفياً. وتُظهر صورة مجهرية بؤرية للتجمعات المهبلية ثلاثية الأبعاد المصابة بـ HSV two حدوث العدوى. كما يمكن أيضاً قياس الخصائص الفيزيائية والوظيفية للخلايا الفردية داخل التجمعات عن طريق قياس التدفق الخلوي، على سبيل المثال، استخدام مقايسة قياس التدفق الخلوي لقياس التعبير السطحي لـ muck one على الخلايا المهبلية الفردية.

أظهرت التجمعات المهبلية ثلاثية الأبعاد نسبة أقل من muck one على سطحها مقارنة بالطبقات الأحادية بعد تطورها. وقد أتاحت هذه التقنية للباحثين في مجالات بيولوجيا الأنسجة والأمراض المعدية دراسة البنية والاستجابات الفسيولوجية للمحفزات. وباستخدام هذه النماذج العضوية، يمكننا محاكاة البيولوجيا البشرية بشكل أفضل.