اندماجي تجميع وعالية الإنتاجية الإصدار البروتين من فيلم البوليمر ومكتبات جسيمات متناهية الصغر

يصف هذا الفيديو التوليف الاندماجي لفيلم بولي أنهيدريد القابل للتحلل الحيوي ومكتبات الجسيمات النانوية ، والكشف عن الإنتاجية العالية لإطلاق البروتين من هذه المكتبات. أولا ، تستخدم أجهزة الترسيب الآلي عالية الإنتاجية لإيداع مجموعة متنوعة من المونومرات في الكوفيت الزجاجي. يتم إجراء تفاعل التكثيف المتعدد عند 180 درجة مئوية و 0.3 تور لمدة 1.5 ساعة.

شروط التفاعل هذه خاصة بتخليق بوليمر البولي أنهيدريد C-P-H-S-A. باستخدام جهاز الترسيب الآلي ، يتم ترسيب المذيب وأي مكونات للتغليف في الكوفيتات التي تحتوي على مكتبة البوليمر. يمكن إجراء صوتنة لضمان الذوبان الكامل للبوليمر والتشتت المنتظم للمكونات الإضافية.

ثم يتم نقل البوليمر المذاب إلى أنبوب من المذيبات غير المذيبة لتصنيع مكتبة الجسيمات النانوية عن طريق ترسيب النانو. يتم استرداد الجسيمات النانوية عن طريق التجفيف بالفراغ أو الترشيح ، ثم يتم نقلها إلى لوحة معدلة 96 تم إطلاقها جيدا. أخيرا ، يتم احتضان المكتبة المحملة بالبروتين في ظل الظروف الفسيولوجية ويتم تقييم حركية إطلاق البروتين باستخدام طريقة الكشف عن مساحة الفلورسنت.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر حركية إطلاق البروتين كدالة لخصائص البوليمر أو ظروف بيئة الإفراج. الميزة الرئيسية لهذا النهج على تقنيات عينة واحدة تقليدية أخرى في كل مرة هي أننا قادرون على تجميع عينات متعددة في وقت واحد. يمكن بعد ذلك فحص هذه العينات بإنتاجية عالية لبوليمر خلية البروتين أو البوليمر أو تفاعلات البوليمر المضيف.

يؤدي هذا بعد ذلك إلى تسريع التصميم العقلاني وتطوير هذه المواد الحيوية لتوصيل الأدوية وهندسة الأنسجة. سيتم عرض الإجراء La Tricia Peterson ، بعد العملية من مختبري. في هذا القسم من الفيديو ، يتم استخدام جهاز ترسيب إنتاجية حياة لإيداع مكتبة مونومر متغيرة تركيبيا بعد تخليق البوليمر.

يستخدم هذا الجهاز لتصنيع مكتبة اندماجية من أفلام البوليمر الفارغة أو المحملة بالبروتين أو الجسيمات النانوية. تتكون المنصة الآلية من مضختين حقاقتين قابلتين للبرمجة وثلاثة مشغلات خطية متصلة في سلسلة بجهاز كمبيوتر على الكمبيوتر. يستخدم برنامج LabVIEW لتوجيه الأوامر إلى مضخات الحقن والمشغلات.

يتم تحميل المحاقن الضيقة سعة 10 سم مكعب في مضخات الحقن بأنابيب شعرية معدنية متصلة من خلال تركيبات قفل الإغراء ، والتي توزع محاليل البوليمر في أكواف زجاجية. في هذا العرض التوضيحي ، سيتم استخدام حمض السييك أو SA مع ستة Biss para oxy heane أو CPH لإنشاء مكتبة من الجسيمات النانوية التي تغلف ألبومين مصل Texas Red Boan. يمكن تكييف التعليمات الواردة في هذا الفيديو والمستندات المصاحبة لتصنيع واختبار مجموعة واسعة من مكتبات أفلام البوليمر والجسيمات النانوية.

لتجميع المكتبات ، ابدأ بإذابة كل مونومر وكلوروفورم بتركيز نهائي يبلغ 25 ملليغرام لكل مليلتر في قارورة زجاجية. بعد ذلك ، قم بتحميل كل محلول في حقنة ضيقة سعة 10 سم مكعب عن طريق شفط المحلول من خلال نهاية قفل الإغراء للحقنة. قم بإزالة أي فقاعات هواء.

بعد ذلك ، قم بتوصيل الأنبوب الشعري المقاوم للصدأ المقاوم للمذيبات بنهاية المحقنة. قم بتأمين الأنابيب الشعرية في المشابك ، وقم بتثبيتها على حامل حلقي. ثم ضع نهاية كلا الأنبوبين الشعريين في فطرة البداية.

لترسيب المونومر. ضع المحاقن على مضخات الحقن القابلة للبرمجة وقم بتثبيتها في موضعها في برنامج عرض المختبر. اضبط المشغلات الخطية على موضع البداية في البرنامج.

ابدأ الترسيب الآلي لمونومرات SA و CPH في الأكواط الزجاجية للمحور x و y و Z. ستقوم المحركات بوضع الأنابيب الشعرية بشكل صحيح في كل أحجام مبرمجة Q و vet و pump لكل مونومر فيها ، مما يخلق مكتبة مونومر متغيرة تركيبيا. بعد ترسيب المونومر.

انقل مكتبة المونومر إلى فرن تفريغ مسخن مسبقا واحتضانها عند 180 درجة مئوية و 0.3 جولة لمدة 1.5 ساعة لتمكين بلمرة التكثيف. بعد الحضانة ، يتم الانتهاء من تصنيع مكتبة البوليمر. بعد ذلك يتم إنشاء جزيئات بوليمر نانوية محملة بالبروتين.

راجع البروتوكول المصاحب لتصنيع مكتبة أفلام البوليمر المحملة بالبروتين لتصنيع مكتبة جسيمات نانوية محملة بالبروتين. أضف البروتين في هذه الحالة ، ألبومين مصل الأبقار الأحمر في تكساس إلى المذيب المناسب ، والذي يجب أن يكون قادرا على إذابة مكتبة البوليمر. هنا ، يتم استخدام كلوريد الميثيلين بتركيز ملليغرامين لكل مليلتر.

املأ حقنة 10 سم مكعب بمذيب يحتوي على Texas Red BSA وضعه في مضخة الحقنة الأولى. ثم ضع نظيفة, حقنة اثنين من cc في مضخة الحقنة الثانية وضع الأنابيب التي تحتوي على 15 مل من المذيب غير المذيب في هذه الحالة, البنتان في حامل الأنبوب المجاور لمنصة القارورة. بعد ذلك في المختبر ، ابدأ برنامج العرض عملية ترسيب المذيب الآلي عن طريق تحديد البرنامج.

بعد بدء البرنامج ، يتم ترسيب المذيب في الكوفيتات التي تحتوي على مكتبة البوليمر ، مما ينتج عنه تركيز بوليمر يبلغ 20 ملليغرام لكل ملليلتر. عندما يتم ترسيب كل المذيب ، اتركه بإذابة البوليمر لمدة دقيقة إلى خمس دقائق. اتبع ذلك بمشاركة اختيارية لضمان إذابة البوليمر بالكامل وتشتت البروتين بشكل موحد.

بعد ذلك ، ابدأ برنامج نقل العينة في عرض المختبر. ثم يتم سحب كل عينة بوليمر مذاب في المكتبة إلى المحقنة الفارغة وتوزيعها في الأنبوب المقابل لها من المذيبات غير المذيبة في حامل العينة. بمجرد نقل كل عينة ، استرجع الجسيمات النانوية المحملة بالبروتين عن طريق وضع مكتبة الجسيمات النانوية في غرفة مفرغة عند 10 ملليمترات من فراغ الزئبق ، أو باستخدام الترشيح الفراغي حتى تتم إزالة المذيب.

للتحقيق في إطلاق BSA المغلف ، ابدأ بلوحة بولي بروبيلين ملحومة عميقة 96 تم تعديلها عن طريق إزالة النصف العلوي من كل جدار بئر من كل عمود مجاور آخر في اللوحة. تسمح إزالة الجزء العلوي من كل بئر بين الأعمدة A و B و C و DENF و GNH بتدفق السائل بين كل زوج من الآبار المجاورة عند ملؤها إلى نقل الحجم الكامل. تتراوح معايير BSA الحمراء في تكساس من 1000 إلى 10 ميكروغرام لكل مليلتر في لوحة البئر العميقة 96.

سيتم استخدامها لحساب كمية البروتين وستأخذ في الحسبان أيضا إعادة تكوين تبريد الفلوروكروم الكتلة المطلوبة من الجسيمات النانوية في المخزن المؤقت PBS ، ثم صوتنة لتفريق الجسيمات بشكل موحد. بعد ذلك ، انقل مكتبة الجسيمات النانوية إلى لوحة البئر العميقة 96 وانتظر حتى تستقر العينات في قاع لوحة البئر. بعد ذلك ، باستخدام ماصة ، املأ جميع الآبار المجاورة ببطء بمخزن مؤقت PBS يصل إلى ربع بوصة من أعلى البئر.

يجب أن يكون هناك حاجز كاف في الآبار المجاورة بحيث يتدفق بحرية بين الآبار. بعد ذلك ، أغلق لوحة التحرير بالغطاء وضعها على حرارة 37 درجة مئوية تحت التحريض. طوال مدة التجربة في نقاط زمنية متزايدة ، استخدم ماسح ضوئي فلوري مسطح 9 ، 400 Typhoon لمسح اللوحة باستخدام مرشحات الإثارة والليزر والانبعاث المناسبة.

بعد المسح ، استخدم برنامج كمية الصور لتحديد كمية البروتين المترافق الفلوروكروم المنبعث في كل إصدار. حسنا ، تم تغليف Texas Red BSA في مكتبة جسيمات بوليمر نانوية تم تصنيعها من مونومرات SA و CPH كما هو موضح في هذا الفيديو لتحديد حركية إطلاق البروتين كدالة لكيمياء البوليمر. تم تحضين الجسيمات النانوية المحملة بالبروتين عند 37 درجة مئوية لمدة شهر واحد ، تم خلالها الحصول على عمليات مسح الفلورسنت في نقاط زمنية متزايدة لقياس كمية إطلاق البروتين.

كما هو موضح هنا ، تم استخدام طريقة الإنتاجية المائية هذه لتحديد حركية إطلاق Texas Red BSA من مكتبة الجسيمات النانوية النانوية A-C-P-H-S-A بولي أنهيدريد. لوحظت اتجاهات تعتمد على الكيمياء مع زيادة معدلات الإطلاق من كيمياء أفلام ساريش. تم الحصول على نتائج مماثلة عند استخدام فحوصات قياس البروتين القياسية.

في تجربة منفصلة ، تم تقييم إصدار Texas Red BSA من مكتبات أفلام CPT CPH Poly Anhydride كما هو موضح هنا بالقرب من حركية إطلاق الترتيب الصفري مع أفلام غنية ب cpeg تطلق البروتين بسرعة أكبر مع التطبيقات المحتملة في المجال الطبي كأجهزة توصيل الأدوية القابلة للتحلل. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن التحكم في ملف الإطلاق المطلوب لدواء علاجي أو مستضد لقاح عن طريق تغيير كيمياء البوليمر. باتباع هذا الإجراء ، تم تطوير طرق اندماجية أخرى للتحقيق في مجالات مثل استقرار البروتين ، والسمية الخلوية ، والتنشيط الخلوي ، والتوزيع الحيوي ل InVivo.

هذه الجوانب مهمة للتصميم العقلاني للمواد الحيوية لتوصيل الأدوية وهندسة الأنسجة. لا تنس ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة وممارسة الإجراءات المعملية الآمنة طوال هذا البروتوكول بأكمله.