اندماجي تجميع وعالية الإنتاجية الإصدار البروتين من فيلم البوليمر ومكتبات جسيمات متناهية الصغر

يصف هذا الفيديو الاصطناع التوليفي لمكتبات من أغشية وجسيمات نانوية من البولي أنهيدريد القابل للتحلل الحيوي، والكشف عالي الإنتاجية عن إطلاق البروتين من هذه المكتبات. أولاً، تُستخدم أجهزة ترسيب آلية عالية الإنتاجية لترسيب مصفوفة متنوعة تركيبياً من المونومرات في كوفيتات زجاجية. ثم يُجرى تفاعل تكثيف متعدد عند 180 °C وضغط 0.3 tor لمدة 1.5 ساعة.

هذه الظروف التفاعلية محددة لتخليق بوليمر بولي أنهيدريد C-P-H-S-A. وباستخدام جهاز الترسيب الآلي، يتم ترسيب المذيب وأي مكونات للتغليف في الكيوفيتات التي تحتوي على مكتبة البوليمر. ويمكن تطبيق الموجات فوق الصوتية لضمان الذوبان الكامل للبوليمر والتوزيع المتجانس للمكونات الإضافية.

بعد ذلك، يتم نقل البوليمر المذاب إلى أنبوب يحتوي على مذيب غير عضوي لتصنيع مكتبة الجسيمات النانوية عن طريق الترسيب النانوي. تُستعاد الجسيمات النانوية بواسطة التجفيف بالتفريغ أو الترشيح، ثم تُنقل إلى لوحة تحرير ذات 96 بئرًا معدلة. وفي النهاية، تُحضن المكتبة المحملة بالبروتين تحت ظروف فسيولوجية، ويتم تقييم حركية إطلاق البروتين باستخدام طريقة الكشف الفلوري الفراغي.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج توضح حركية إطلاق البروتين كدالة لخصائص البوليمر أو ظروف بيئة الإطلاق. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا النهج مقارنة بالتقنيات التقليدية الأخرى التي تعتمد على فحص عينة واحدة في كل مرة في قدرتنا على تخليق عينات متعددة في وقت واحد. ويمكن بعد ذلك فحص هذه العينات بإنتاجية عالية لدراسة التفاعلات بين البروتين والبوليمر، أو الخلية والبوليمر، أو التفاعلات بين المضيف والبوليمر.

يؤدي هذا إلى تسريع التصميم العقلاني وتطوير هذه المواد الحيوية لإيصال الأدوية وهندسة الأنسجة. ستقوم La Tricia Peterson، وهي باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري، بشرح هذا الإجراء. في هذا الجزء من الفيديو، يتم استخدام جهاز ترسيب عالي الإنتاجية لترسيب مكتبة مونومرات متغيرة التركيب بعد عملية تخليق البوليمر.

يُستخدم هذا الجهاز لتصنيع مكتبة توافقية من أغشية بوليمرية أو جسيمات نانوية، سواء كانت فارغة أو محملة بالبروتين. تتكون المنصة الآلية من مضختي حقن قابلة للبرمجة وثلاثة مشغلات خطية متصلة على التوالي بجهاز كمبيوتر. ويُستخدم برنامج LabVIEW لإرسال الأوامر إلى مضخات الحقن والمشغلات.

يتم تحميل محاقن محكمة الغلق سعة 10 cc في مضخات المحاقن مع توصيل أنابيب شعرية معدنية عبر وصلات Luer lock، والتي تقوم بتوزيع المحاليل البوليمرية داخل كيوفات زجاجية. في هذا العرض التوضيحي، سيتم استخدام حمض السيكيك (seic acid) أو SA مع 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane أو CPH لإنشاء مكتبة من الجسيمات النانوية التي تغلف ألبومين مصل البقر المصبوغ بـ Texas Red. يمكن تكييف التعليمات الواردة في هذا الفيديو والمستندات المرفقة لتصنيع واختبار مجموعة واسعة من مكتبات الأغشية البوليمرية والجسيمات النانوية.

لتخليق المكتبات، ابدأ بإذابة كل مونومر في الكلوروفورم بتركيز نهائي قدره 25 mg/mL في قارورة زجاجية. بعد ذلك، قم بتعبئة كل محلول في سرنجة محكمة الإغلاق سعة 10 cc عن طريق سحب المحلول من خلال طرف القفل اللولبي (lure lock) للسرنجة. قم بإزالة أي فقاعات هواء.

بعد ذلك، قم بتوصيل الأنبوب الشعري المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ والمزود بقفل تثبيت (lure lock) المقاوم للمذيبات بطرف المحقنة. ثبت الأنابيب الشعرية في مشابك، ثم ثبتها على حامل حلقي. بعد ذلك، ضع طرف كلا الأنبوبين الشعريين في فتحة البداية.

لترسيب المونومر. ضع المحاقن على مضخات المحاقن القابلة للبرمجة وثبتها في موضعها باستخدام برنامج lab view. اضبط المشغلات الخطية على موضع البداية في البرنامج.

ابدأ عملية الترسيب الآلي لمونومرات SA و CPH في الكيوفيتات الزجاجية عبر المحاور x و y و Z. ستعمل المشغلات على وضع الأنابيب الشعرية بدقة في كل كيوفيت، وضخ الأحجام المبرمجة من كل مونومر بداخلها، مما يؤدي إلى إنشاء مكتبة مونومرات متنوعة من حيث التركيب. بعد عملية ترسيب المونومرات.

انقل مكتبة المونومرات إلى فرن تفريغ مسخن مسبقاً، وتحضن عند 180 °C وضغط 0.3 tour لمدة 1.5 ساعة لتمكين بلمرة التكاثف. بعد التحضن، تكتمل عملية تصنيع مكتبة البوليمرات. بعد ذلك، يتم إنتاج جسيمات نانوية بوليمرية محملة بالبروتين.

راجع البروتوكول المصاحب الخاص بتصنيع مكتبة أغشية بوليمرية محملة بالبروتين لتصنيع مكتبة جسيمات نانوية محملة بالبروتين. أضف البروتين في هذه الحالة، وهو Texas red bovine serum albumin، إلى المذيب المناسب، والذي يجب أن يكون قادراً على إذابة مكتبة البوليمر. هنا، يُستخدم methylene chloride بتركيز 2 mg/mL.

املأ محقنة سعة 10 cc بالمذيب الذي يحتوي على Texas Red BSA وضعها في مضخة المحقنة الأولى. ثم ضع محقنة نظيفة وفارغة سعة 2 cc في مضخة المحقنة الثانية، وضع أنابيب تحتوي على 15 milliliters من مذيب غير قطبي، وفي هذه الحالة يكون البنتان (pentane)، في حامل الأنابيب المجاور لمنصة القوارير. بعد ذلك، في برنامج lab view، ابدأ عملية ترسيب المذيب الآلية عن طريق تحديد البرنامج.

بعد بدء البرنامج، يتم وضع المذيب في الكيوفيتات التي تحتوي على مكتبة البوليمر، مما يؤدي إلى الحصول على تركيز بوليمر يبلغ 20 mg/mL. وعند الانتهاء من وضع المذيب بالكامل، يُترك ليذيب البوليمر لمدة تتراوح من دقيقة واحدة إلى خمس دقائق. يتبع ذلك عملية تحريك اختيارية لضمان الإذابة الكاملة للبوليمر والتوزيع المتجانس للبروتين.

بعد ذلك، ابدأ برنامج نقل العينات في برنامج LabVIEW. ثم يتم سحب كل عينة من البوليمر المذاب في المكتبة إلى المحقنة الفارغة وتوزيعها في الأنبوب المقابل لها الذي يحتوي على المذيب غير المذيب في حامل العينات. وبمجرد نقل كل عينة، استعد الجسيمات النانوية المحملة بالبروتين عن طريق وضع مكتبة الجسيمات النانوية في غرفة تفريغ عند ضغط 10 millimeters of mercury، أو باستخدام الترشيح الفراغي حتى يتم إزالة المذيب.

لبحث عملية تحرير BSA المغلف، ابدأ باستخدام لوحة بولي بروبيلين عميقة ذات 96 بئرًا، تم تعديلها عن طريق إزالة النصف بوصة العلوي من جدار كل بئر في كل عمودين متجاورين في اللوحة. تتيح إزالة الجزء العلوي من كل بئر بين الأعمدة A وB، وC وD، وE وF، وG وH تدفق السوائل بين كل زوج من الآبار المتلاصقة عند ملئها حتى حجم النقل الكامل. يتم وضع معايير Texas red BSA التي تتراوح تركيزاتها من 1000 إلى 10 micrograms per milliliter في لوحة الـ 96 بئرًا العميقة.

ستُستخدم هذه العينات لحساب كمية البروتين وسوف تأخذ في الاعتبار أيضاً خمود الفلوروكروم؛ أعد تشكيل الكتلة المطلوبة من الجسيمات النانوية في محلول PBS المنظم، ثم قم بعملية السونيكة لتوزيع الجسيمات بشكل متجانس. بعد ذلك، انقل مكتبة الجسيمات النانوية إلى لوح الآبار العميقة سعة 96 بئراً، وانتظر حتى تستقر العينات في قاع لوح الآبار. ثم، وباستخدام الماصة، املأ جميع الآبار المجاورة ببطء بمحلول PBS المنظم حتىما تبقى ربع بوصة من أعلى البئر.

يجب توفر كمية كافية من المحلول المنظم في الآبار المجاورة لضمان تدفقه بحرية بين الآبار. بعد ذلك، يتم إغلاق لوحة التحرير بالغطاء ووضعها عند 37 درجة مئوية مع الرج. وطوال فترة التجربة وفي نقاط زمنية تدريجية، استخدم ماسح Typhoon المسطح الفلوري 9,400 لمسح اللوحة باستخدام مرشحات الإثارة والليزر والانبعاث المناسبة.

بعد عملية المسح، استخدم برنامجاً لتحليل الصور الكمي لتقدير كمية البروتين المقترن بالفلوروكوم الذي تم تحريره في كل عملية تحرير. وفي هذه التجربة، تم تغليف Texas Red BSA داخل مكتبة من الجسيمات النانوية البوليمرية المُصنعة من مونومرات SA وCPH كما هو موضح في هذا الفيديو، وذلك لتحديد حركية تحرير البروتين كدالة في كيمياء البوليمر. تم تحضين الجسيمات النانوية المحملة بالبروتين عند 37 درجة Celsius لمدة شهر واحد، حيث أُجريت عمليات مسح فلورية في نقاط زمنية متزايدة لتقدير كمية البروتين المتحرر.

كما هو موضح هنا، استُخدمت طريقة الإنتاجية المائية هذه لتحديد حركية تحرر Texas Red BSA من مكتبة جسيمات نانوية من poly anhydride من نوع A-C-P-H-S-A. لُوحظت اتجاهات تعتمد على الكيمياء مع زيادة معدلات التحرر من كيميائيات غشاء Sarich. وتم الحصول على نتائج مماثلة عند استخدام مقاييس كمية البروتين القياسية.

في تجربة منفصلة، تم تقييم تحرر Texas Red BSA من مكتبات أغشية CPT CPH Poly Anhydride، وكما هو موضح هنا، لوحظت حركية تحرر من الرتبة صفر تقريبًا، حيث أطلقت الأغشية الغنية بـ cpeg البروتين بأسرع معدل، مما يفتح آفاقاً لتطبيقات محتملة في المجال الطبي كأجهزة قابلة للتحلل الحيوي لإيصال الأدوية. وتشير هذه النتائج إلى إمكانية التحكم في ملف التحرر المطلوب لدواء علاجي أو مستضد لقاح عن طريق تغيير كيمياء البوليمر. وبناءً على هذا الإجراء، تم تطوير طرق توليفية أخرى لاستقصاء مجالات مثل استقرار البروتين، والسمية الخلوية، والتنشيط الخلوي، والتوزيع الحيوي InVivo.

تعد هذه الجوانب مهمة للتصميم العقلاني للمواد الحيوية المستخدمة في إيصال الأدوية وهندسة الأنسجة. لا تنسَ ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة واتباع إجراءات المختبر الآمنة طوال هذا البروتوكول بالكامل.