مهام سير العمل صفها البروتيني وحمض حفز توظيف-

يوضح هذا العرض التقديمي سير العمل لعملية وسم النواتج البروتينية المهضومة والببتيدات الاصطناعية بالنظائر المستقرة باستخدام الماء المخصب بـ oxygen 18؛ أولاً في تجربة السلسلة الزمنية التي يحفزها البروتياز، حيث يتم تحضين الركيزة والبروتياز في وجود ماء مخصب بـ 50% oxygen 18 لدمج ذرات oxygen 18، ثم يتم الوسم المزدوج للبروتياز من خلال تكرار تحضين نواتج الانقسام بعد الهضم مع البروتياز المعني في وجود ماء مخصب بـ 50% oxygen 18.

يقوم سير عمل EO بدمج ذرات oxygen 18 في المجموعات الوظيفية بتحفيز حمضي على فترات زمنية محددة. ويؤدي وضع حصص من مخاليط التفاعل مع المادة المصفوفة (matrix) على ألواح الهدف المصبوبة عند الحصول على بيانات مطيافية الكتلة إلى إنشاء مخططات زمنية طيفية لتفاعلات انشطار الببتيد، بالإضافة إلى مخططات دمج oxygen 18 لأنواع الببتيدات الفردية، حيث يتم اختيار نواتج الانشطار الموسومة لتحديد التسلسل بناءً على MSM S. وفي النهاية، توفر سيرات العمل هذه أدوات متعددة الاستخدامات للدراسات البروتومية الكمية والنوعية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أبحاث البروتياز، مثل تحديد المعدل، والخطوات المحددة للسرعة، والوسائط التفاعلية في المسارات البروتينية المعقدة. وتوفر البصمات البروتينية التي تم تحديدها بواسطة التسلسل الزمني القديم حقائق مهمة فيما يتعلق بخصوصية الركيزة. بالإضافة إلى ذلك، فإن مؤقتات البيانات تستخدم أيضاً المعلومات الحركية.

سيقوم الآن باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري بتوضيح الإجراء. يراقب سير عمل المسار الزمني لـ paleo ديناميكيات تفاعلات الانقسام البروتيني بناءً على دمج الأكسجين 18 المحفز بواسطة البروتياز؛ بالنسبة للتفاعل بحجم 20 µL، أضف ببتيدات العينة إلى منظم تفاعل البروتياز الذي يحتوي على ماء غني بـ الأكسجين 18، ثم اخلط 0.5 µL من خليط التفاعل مع 0.5 µL من المادة المصفوفة (matrix)، وضعها على لوحة هدف MALDI من نوع opti to 3 84 واترك قطرات المذيب في درجة حرارة الغرفة حتى تجف. وفي هذه الأثناء، قسم خليط التفاعل إلى أنبوبين.

عينة وضابط لأنبوب العينة. أضف البروتياز المطلوب وحضنه في درجة حرارة تفاعل الإنزيم الموصى بها. أضف النقاط الزمنية المحددة.

اسحب كمية مقدارها 0.5 µL لخلطها مع 0.5 µL من المصفوفة (matrix) ووضعها على لوحة الأهداف المتعددة. انتقل إلى تحليل ديناميكيات التفاعل باستخدام تحليل MALDI-TOF MS كما هو موضح لاحقاً في سير عمل وسم ما بعد الهضم هذا؛ حيث تقوم الإنزيمات المنتجة مثل trypsin بتحفيز تفاعل تبادل أكسجين الكربوكسيل لدمج O18. بعد إجراء هضم البروتين بدون وسم O18، مرر نواتج التحلل عبر عمود PepClean C18 لإزالة أنشطة البروتياز المتبقية.

بعد ذلك، أعد تعليق العينات في 20 µL من منظم تفاعل التريبسين الذي يحتوي على ماء مخصب بالأكسجين 18. خذ عينة بحجم 0.5 µL واخلطها بحجم مساوٍ من المصفوفة. ثم ضع النقاط على لوحة MALDI target plate من نوع opti off 3 84 لتجف في الهواء.

بعد ذلك، قم بتقسيم محلول التفاعل إلى أنابيب تحكم وأنابيب عينة. أضف trypsin وقم بالتحضين عند 37 °C. ولمراقبة التفاعل، اسحب كمية أليكوت قدرها 0.5 µL.

اخلط مع 0.5 µL من المصفوفة (matrix) ثم ضع النقطة على لوحة مالدي (MALDI plate). قم بتحليل ديناميكيات تفاعل تبادل أكسجين الكربوكسيل هذا باستخدام تحليل Maldi Toof MSM S. يعتمد سير عمل التسلسل الزمني لـ IEO على تفاعلات تبادل أكسجين الكربوكسيل المحفزة بالحمض في المجموعات الطرفية والسلاسل الجانبية للببتيدات الحمضية.

أولاً، يتم تحضين 50 nanomolar من الببتيدات الفردية مع ماء مخصب بالأكسجين 18 بنسبة واحد إلى واحد في وجود أو غياب 0.1% من حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك النهائي. يتم أخذ عينات بحجم 0.5 µL من التفاعل يومياً لمدة 48 يوماً وخلطها مباشرة مع المادة المصفوفة (matrix) على لوحة MALDI target. تُقدم لوحة MALDI TARGETT بانتظام لتحليل MALDI TOF MS/MS. هذا القسم مفصل في المخطوطة المرفقة.

أولاً، يتم الحصول على أطياف كتلة (MS Spectra) ثلاثية في وضع الأيونات الموجبة. وبعد معايرة المضاعف وإعداد عملية الحصول على بيانات MS، يتم الحصول على لقطات فردية للأطياف الفرعية. بعد ذلك، يتم تصدير ملفات بيانات MS من برنامج الحصول على البيانات Explorer من سلسلة 4,000.

بعد ذلك، يتم الاستيراد إلى نظام معلومات داخلي يستخدم برنامج mascot distiller للمعالجة الطيفية وكشف القمم. قم بإجراء عملية فك الالتفاف (Deconvolution) للأغلفة النظائرية وتحديد نسب دمج oxygen 18 تلقائياً؛ حيث تُسجل نسب دمج oxygen 18 بوصفها المساهمات النسبية لأنواع النظائر الببتيدية الفردية في الغلاف النظائري بأكمله. قم بتصفية قائمة الصناديق (bin list) وتصنيف ثلاث قيم على الأقل بعرض كتلي 100 PP m لكل تجربة من تجارب المسار الزمني.

استخرج الكتل الجزيئية لجميع أنواع الببتيدات المكتشفة من ملفات بيانات MS المرتبطة. استخدم الآن X pacey find pep set بحد تسامح لقبول خطأ في الكتلة قدره 200 PPM. قارن قائمة التصنيف (bin list) ببيانات منتجات الانقسام البروتيني المتوقعة من تسلسل الببتيد الركيزة.

باشر بالحصول على أطياف msms لجميع قيم الكتلة لنواتج الانشطار التي توقعتها أداة find pep وللقيم الصندوقية المرتبطة بدمج oxygen 18. اجمع بيانات MSM S بمعدل 50 لقطة بنمط عشوائي لكل طيف فرعي، وبحد أقصى 40 طيفاً فرعياً لكل بقعة، ثم قم بتصدير ملفات msms. بعد ذلك، صَدّر ملفات بيانات MSM S إلى نظام التحليل للكشف عن القمم واستخراج قوائم قمم MSM S المرتبطة ببيانات bend MS المقابلة لتحديد الببتيد.

اضبط معاملات البحث هذه في محرك البحث mascot: عدم تحديد خصوصية الإنزيم، وتفاوت كتلة أيون السلف بمقدار 150 PPM، وتفاوت كتلة أيون الشظية بمقدار 0.2 Dalton. قم بإجراء البحث لقوائم M-S-M-S-P مقابل قاعدة بيانات Swiss Pro. يمكن التحقق من تحديد الببتيدات بشكل إضافي باستخدام برنامج data explorer من خلال تأكيد أنماط دمج الأكسجين 18 المميزة عبر أيونات الشظايا الخاصة بك لمخططات الوقت الطيفي.

قم بتصدير ملفات بيانات MS لكل نقطة زمنية للتفاعل من ملفات ASCI الخاصة ببرنامج مستكشف البيانات باستخدام ماكرو. بعد ذلك، استورد الملفات إلى برنامج لتحليل البيانات والرسوم البيانية واعرضها على شكل مخططات شلالية (waterfall plots) لإنشاء مخططات دمج الأكسجين 18 لكل انحناء. وبالنسبة لمنتجات انشطار الببتيد، استخرج المساهمات النسبية لأنواع نظائر الببتيد الفردية عبر جميع النقاط الزمنية للتفاعل، ثم قم برسمها مقابل الوقت.

تعرض مخططات الوقت الطيفي مثل هذا المخطط ديناميكيات تفاعلات الانقسام البروتيني. يحلل هذا الاختبار انقسام الببتيد النشط بيولوجياً endo and C بواسطة إنزيم تحويل البطانة واحد. يقوم ترتيب الشلال برسم أطياف MS لتجارب المسار الزمني القديمة لمراقبة تحلل الركيزة وظهور المنتجات الوسيطة والنهائية في آن واحد.

يتم تحديد نواتج الانشطار بواسطة MSMS وبصمات دمج الأكسجين 18 المميزة لأغلفتها النظائرية. تشير آلية التفاعل هذه لإنزيم التريبسين إلى أن البروتيازات المقتطعة تتوسط دمج ما يصل إلى ذرتي أكسجين 18 في نواتج انشطار الببتيد. في سير عمل الوسم القائم على البروتياز، يؤدي تفاعل انشطار الرابطة الببتيدية إلى نسبة دمج لأكسجين 18 مفرد تبلغ 50% لنواتج انشطار الببتيد المتولدة حديثاً؛ بينما تقوم البروتيازات مثل التريبسين، التي تعيد الارتباط بنواتج التفاعل، بتحفيز دمج ذرة أكسجين 18 ثانية عبر تفاعل تبادل أكسجين الكربوكسيل.

عند حالة التوازن، تتوزع علامة الأكسجين 18 بنسبة واحد إلى اثنين إلى واحد في النواتج غير الموصومة، والموصومة أحادياً، والموصومة ثنائياً. وفي سير عمل وسم النهايات البروتينية قبل الهضم، لا تحدث أي انقسامات في الروابط الببتيدية. بدلاً من ذلك، يعتمد دمج ما يصل إلى ذرتي أكسجين 18 حصرياً على تفاعل تبادل أكسجين الكربوكسيل.

وبناءً على ذلك، فإن دمج الأكسجين 18 لا يحدث إلا مع البروتيازات التي تعيد الارتباط بنواتج انقسام الببتيد الخاصة بها. ويؤدي وسم الأكسجين 18 المحفز بالحمض إلى دمج ذرتي أكسجين 18 لكل مجموعة كربوكسيل. وعلى مدار هذه التجربة، يمكن تحديد إزاحات الكتلة المتعددة بمقدار زائد 2 دالتون للغلاف النظائري للأنجيوتنسين 1 من خلال امتصاص ذرات الأكسجين 18.

من خلال الجمع بين وسم OPE ومطيافية الكتلة عالية الدقة بطريقة تحليل زمنية، تتيح طريقة المسار الزمني القديم (paleo time course) تحليلاً ديناميكياً لتوليد النواتج الببتيدية. ويمكن استخدام هذا المقايسة لإنتاج ببتيدات مستقرة وموسومة موضعياً للدراسات البروتومية الكمية والنوعية، ولتقييم الحركية التي يتم من خلالها توليد ببتيدات Protopic.

تم تصميم المسار الزمني لـ Paleo لتقييم مسارات التحلل البروتيني في ظل ظروف ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. وقد مهدت هذه التقنية الطريق لمسحنا الأخير للعمليات التحللية في البيئات الدقيقة للسرطان البشري.