تقارب الأمطار من GEFs-رو بالموقع باستخدام ضريبة السلع والخدمات الموسومة البروتين رو المسخ (GST-RhoA (G17A)) من Lysates الخلايا الظهارية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تتبع تنشيط RO لعوامل تبادل G-D-P-G-T-P محددة أو gafs في الخلايا المستزرعة، وذلك من خلال استخدام بروتين اندماجي mutant RO A GST الذي يتميز بألفة عالية تجاه gs المنشطة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إنتاج بروتين row الطافر المسمى بـ GST في البكتيريا، ثم يتم بعد ذلك تنقية GST row A المقترن بالخرزات.

بعد ذلك، يتم تقييم نقاوة وتركيز بروتين GST RO A باستخدام تقنية SDS page. وأخيراً، يتم تحضير مستخلصات الخلايا وإجراء مقايسة تريب GEF باستخدام بروتين GST RO A. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر زيادة في تريب GS المنشط في الخلايا المعالجة من خلال تحليل western blot للبروتينات المترسبة باستخدام جسم مضاد نوعي لـ GF والتقدير الكمي عن طريق قياس الكثافة الضوئية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على عدد من الأسئلة المثيرة في مجال GTPS، مثل كيفية تنظيم العديد من عوامل تبادل G-D-P-G-T-P بطريقة محددة للإشارة، وكيف يتم تنسيق نشاطها؟ وبشكل عام، قد يواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبة في البداية لأن بروتين GST RO G 17 A غير مستقر نسبيًا ويمكن أن يتحلل أثناء التحضير. ومن المهم أيضًا تذكر إجراء مقايسة ترسيب GF بسرعة وبشكل متسق. سيقوم Pfizer Vahid، طالب الماجستير في مختبري، بشرح هذا الإجراء لتحويل e coli.

قم بنقل ربع لتر من خلايا DH5α المختصة بسرعة إلى حمام ثلجي، ثم أضف ميكرولتر واحد من DNA PX row A G 17 A بتركيز 25 إلى 50 نانوجرام لكل ميكرولتر. قم بنقر الأنبوب لخلط المحتويات واتركه في الحضانة على الثلج لمدة 30 دقيقة. قم بصدم الخلايا حرارياً عند 42 °C لمدة 45 ثانية، ثم أعدها إلى الثلج لمدة دقيقتين.

أضف 900 µL من وسط sock وقم بالتحضين لمدة ساعة واحدة عند 37 °C مع الرج. وباستخدام ماصة باستور معقمة ومثنية، قم بفرد 50 إلى 100 µL من البكتيريا المحولة على طبق LB agar و persin مُعد مسبقاً. قم بتحضين الطبق في وضع رأسي في حضانة عند 37 °C لمدة خمس دقائق، ثم اقلبه واتركه ينمو طوال الليل.

اختر مستعمرة معزولة جيداً من البكتيريا المحولة واستخدمها لتلقيح 50 milliliters من وسط LB المضاف إليه ampicillin. قم بتحضينها طوال الليل عند 37 degrees SIUs مع الرج. عندما تصل المزرعة إلى الكثافة الكاملة، خففها بإضافة 450 milliliters من وسط LB ampicillin واستمر في تنميتها لمدة 30 دقيقة إضافية. عند درجة حرارة 37 degrees Celsius، حفز البكتيريا لإنتاج row protein عن طريق إضافة 500 microliters من 100 millimolar IPTG إلى مزرعة حجمها 500 milliliter.

قم بخفض درجة الحرارة إلى 22 إلى 24 درجة Celsius واترك المزرعة تنمو لمدة 16 ساعة تقريباً. قم بطرد المزرعة مركزياً بسرعة 3,600 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. قم بتجميد الرواسب لمدة ساعة واحدة على الأقل، أو يفضل طوال الليل عند درجة حرارة ناقص 80 درجة Celsius.

بعد تحضير 200 milliliters من محلول التحلل (lysis buffer) كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، قم بتحضير محلول التحلل المضاف (lysis buffer plus) عن طريق تدعيم 10 milliliters بـ 1 millimolar من DTT و 1 millimolar من PMSF وقرص واحد من مثبط البروتياز (protease inhibitor tablet) مع العمل على الثلج. أضف 10 milliliters من محلول التحلل المضاف إلى رواسب Thor وقم بتعليقها جيداً عن طريق السحب بالماصة والرج باستخدام جهاز vortex. قم بإجراء السونكة (Sonicate) للمعلق على الثلج لمدة دقيقة واحدة عند الإعداد الرابع مع نبضة بنسبة 50%pulse.

قم بطرد المستخلص الناتج عن المعالجة بالموجات فوق الصوتية مركزياً بسرعة 15,000 إلى 20,000 ×g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، ثم انقل المستخلص المصفى إلى أنبوب معقم بسعة 15 مل ومغلق بغطاء. قم بتحضير حبيبات الجلوتاثيون الكروية عن طريق خلط المعلق بتركيز 75% بلطف، واستخدم طرف ماصة واسع الفتحة لنقل 335 µL إلى أنبوب سعة 15 مل. أضف 10 mL من محلول PBS البارد وقم بطرده مركزياً بسرعة 500 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

تخلص من المادة الطافية. أضف 1 mL من منظم التحلل بلس (lysis buffer plus) إلى الخرزات ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى. تخلص من المادة الطافية مجدداً وأضف منظم التحلل.

بالإضافة إلى ذلك، ولتحضير ملاط بتركيز 50%، اخلط 50 µL مرتين من ملاط الخرز المتوازن مع الطافي المُحضّر. يتم التدوير عند درجة حرارة 4 °C لمدة 45 دقيقة. قم بتحضير HBS plus عن طريق تزويد 100 mL من منظم HBS بـ 5 mM من كلوريد المغنيسيوم و 1 mM من DTT، ثم قم بطرد الطافي والخرز مركزياً عند 500 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

تخلص من السائل الطافي واغسل الخرزات مرتين باستخدام 10 milliliters من lysis buffer plus ومرتين باستخدام 10 milliliters من HBS plus. بعد الغسلة الأخيرة، قم بتحضير ملاط بتركيز 50% عن طريق إعادة تعليق الخرزات في HBS plus مدعم بمثبط البروتياز. خفف 10 microliters من تحضير الخرزات النهائي باستخدام two times lam ly sample buffer الذي يحتوي على beamr cap two ethanol.

ثم قم بتحضير ثلاث عينات قياسية من BSA عن طريق خلط 10 µL، ثم 5 µL، ثم 2.5 µL من مخزون BSA بتركيز 2 mg/mL مع 10 µL من منظم Laemmli.

اغلِ العينات لمدة خمس دقائق، ثم قم بطردها مركزياً لفترة وجيزة، وقم بتشغيلها جميعاً مع علامة الوزن الجزيئي على هلام بولي أكريلاميد SDS بتركيز 10% بعد الصبغ، ثم قم بتقدير صف GST row A G 17 A باستخدام معايير BSA كمرجع. وزع حجماً متساوياً من الخرزات التي تحتوي على حوالي 10 إلى 15 micrograms من البروتين في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 milliliter. للتحضير لمقايسة GF pull down، قم بتنمية الخلايا المستخدمة حتى تصل إلى مرحلة التلاقي في أطباق قطرها 10 centimeter، واجعلها محرومة من المصل لمدة ثلاث ساعات على الأقل قبل إجراء المقايسة.

قبيل بدء المقايسة مباشرةً، قم بتحضير محلول التحلل (lysis buffer plus) مع مثبطات البروتياز مع العمل على الثلج. تخلص من وسط الزرع من الأطباق واغسلها باستخدام محلول HBS بارد جداً.

قم بإزالة كل من HBS وأضف 700 microliters من Lysis Buffer plus إلى كل طبق. قم بإمالة الأطباق لتغطية جميع المناطق.

بعد ذلك، يتم كشط وجمع المواد المتحللة في أنابيب سعة 1.5 milliliter مرقمة. يتم الطرد المركزي بسرعة 15, 000 ×g لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة 4 °C. يتم الاحتفاظ بالراشح من أجل المقايسة؛ وفي حال كان عدد الخلايا متكافئاً في كل طبق، يتم سحب 30 µL من كل راشح وخلطها مع 30 µL من منظم عينة التحلل المختزل بتركيز 2x.

بعد ذلك، يتم الغليان ثم يوضع الخليط جانباً على الثلج. تُضاف السوائل الطافية المتبقية إلى حصص من حبيبات GST row a G 17 A وتُدوّر لمدة 45 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. يتم تدوير الحبيبات باستخدام جهاز الطرد المركزي بسرعة 6,800 ×g لمدة 10 ثوانٍ عند درجة حرارة 4 °C.

تخلص من الراشح واغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام منظم ليزيس (lysis buffer). باستخدام حقنة سعة 1 CC مزودة بإبرة مقاس 30 gauge، قم بإزالة الغسلة الأخيرة تماماً وأضف 20 µL من منظم عينة لالي المختزل بتركيز ضعفين (two times reducing laly sample buffer). اغلي العينات لمدة خمس دقائق، ثم قم بالطرد المركزي لترسيب الخرزات، وقم بتحليل نواتج تحلل الخلايا الكلية وعينات البروتين المترسبة باستخدام جل SDS page بالنسب المئوية المناسبة لحجم GF الذي يتم دراسته.

أخيراً، قم بإجراء تحليل لطخة ويسترن (western blotting) للكشف عن نجاح مقايسة GF ذات الصلة. يظهر هنا الكشف عن تنشيط عامل التبادل GFH one. حيث يلتقط البروتين A G 17 A في الصف A بعض GFH one من نواتج تحلل الخلايا الضابطة، مما يشير إلى أن GFH one يمتلك نشاطاً قاعدياً.

ومع ذلك، زادت الكمية المترسبة في الخلايا المعالجة بالسيتوكين الالتهابي tumor necrosis factor alpha بما يتفق مع الفكرة القائلة بأن TNF alpha ينشط G FH one. ومن المهم ملاحظة أن مستخلص الخلية الكلي يظهر كميات مماثلة من gfh one في كل من العينة الضابطة والعينة المعالجة، مما يشير إلى أن المعالجة لم تغير مستويات G FH one وأن كمية المدخلات المستخدمة في المقايسة كانت متساوية. وأثناء تطبيق هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على بروتين GSE RO G 17 A ومستخلصات الخلايا على الثلج.

قم بإجراء مقايسة GF بسرعة وبشكل متسق، واستخدم ضوابط إيجابية كافية لتمكين إبطال النتائج واستكشاف الأخطاء وإصلاحها.