Endothelialized على microfluidics لدراسة التفاعلات الاوعية الدموية الدقيقة في الأمراض الدموية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء جهاز ميكروفلويديك (مائع مجهري) مغطى بخلايا بطانية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصنيع قالب الميكروفلويديك، ثم تتمثل الخطوة الثانية في إنشاء قناة PDMS.

بعد ذلك، يتم استزراع الخلايا البطانية في الجهاز. وتتمثل الخطوة النهائية في تنمية الخلايا داخل الجهاز. وفي النهاية، تُستخدم الأجهزة الموائعية الدقيقة المكسوة بالخلايا البطانية لإظهار التفاعلات بين الخلايا في المختبر.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنةً بالطرق الحالية في أنها تمنح الباحث تحكماً دقيقاً في الظروف البيولوجية والبيوفيزيائية، كما أنها متوافقة مع المجهر الفلوري. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية معمقة حول التفاعلات البيوفيزيائية بين الخلايا في الأمراض الدموية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على ظواهر أخرى مثل بيولوجيا الكريات البيضاء، وانتقال السرطان، وبيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم. وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في استخدام هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن الظروف يجب أن تكون محكومة بدقة لضمان نجاح استقرار الخلايا.

كجزء من التحضير للتصنيع، يتم إنشاء قناع ضوئي عن طريق إرسال صورة تصميم بمساعدة الحاسوب لجهاز الموائع الدقيقة إلى مورد أقنعة خارجي. وبمجرد استلامه، يتكون القناع من طبقة كروم على زجاج الصودا والجير. ويبلغ عرض قناة الموائع الدقيقة هنا 30 microns.

لبدء تصنيع الجهاز الموائع دقيقية، يتم تنظيف رقاقة سيليكون عارية باستخدام محلول بيرانيا لمدة 15 دقيقة، ثم تُشطف بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 ثوانٍ. بعد ذلك، تُغمر رقاقة السيليكون في حمض الهيدروفلوريك لمدة 30 ثانية، وتُشطف بالماء منزوع الأيونات لمدة 10 ثوانٍ تقريبًا. تالياً، وباستخدام جهاز طلاء دوراني، يتم طلاء الرقاقة بطبقة من مقوم الضوء micro chem SU 8 20 25 بارتفاع 30 microns وبسرعة دوران تبلغ 3000 دورة في الدقيقة.

ضع الرقاقة المطلية بـ SU 8 20 25 على لوح تسخين مضبوط عند 95 °C لمدة خمس دقائق للتخلص من المذيب الزائد. لا يُنصح باستخدام الفرن في هذه الخطوة. الآن، ضع القناع الضوئي فوق الرقاقة وعرضها للأشعة فوق البنفسجية (UV) في جهاز محاذاة الأقنعة (mask liner) لإجراء الربط التشابكي للمقاوم الضوئي SU 8 20 25.

بعد عملية التشبيك، ضع الرقاقة مجددًا على اللوح الساخن عند 95 درجة Celsius لمدة خمس دقائق إضافية، وذلك لمزيد من تسريع بلمرة مادة المقاومة الضوئية SU 8 20 25. ثم اغمر الرقاقة في محلول تطوير SU eight، المكون أساسًا من P-G-M-E-A، لمدة أربع دقائق.

سيؤدي ذلك إلى إزالة مادة SU 8 20 25 المقاومة للضوء غير المترابطة تشابكياً. اشطف الرقاقة التي تم تحميضها حديثاً باستخدام كحول أيزوبروبيل بتركيز 100% لمدة 10 ثوانٍ، ثم جففها باستخدام النيتروجين المضغوط، أو عن طريق ترك المذيب يتبخر من الرقاقة في خزانة استنشاق نظيفة لعدة دقائق. الآن، قم بتثبيت الرقاقة المجففة باستخدام شريط لاصق في مركز طبق بتري، مع الحرص على وضع الشريط عند حواف الرقاقة.

أخيرًا، يتم سحب 500 µL من sigma coat ونقله بالماصة فوق الرقاقة. غطِّ طبق بتري بالغطاء، ثم قم بتدوير الطبق لضمان التغطية الكاملة للرقاقة. ارفع الغطاء واترك الرقاقة تجف لعدة دقائق حتى يتبخر المذيب بالكامل.

بعد خلط بوليمر PDMS وعامل المعالجة بنسبة وزنية تبلغ 10 إلى 1، قم بإزالة فقاعات الهواء باستخدام مجفف تفريغي لعدة دقائق إلى ساعة واحدة، وذلك حسب قوة نظام التفريغ المتاح. بعد إزالة جميع فقاعات الهواء، صب الخليط في الطبق بحيث يتم تغطية الرقاقة وسطح الطبق، وذلك لإنشاء طبقة من PDMS يبلغ سمكها خمسة مليمترات تقريباً.

قم أيضاً بتصنيع قطعة رقيقة ملساء من PDMS بسمك 1 mm. ثم قم بمعالجة الخليط في فرن عند درجة حرارة 60 °C طوال الليل. وفي اليوم التالي، استخدم سكيناً أو مشرطاً للقطع حول الرقاقة وإزالة العديد من أجهزة PDMS للموائع الدقيقة.

بعد ذلك، قم بقص الورقة لعزل الأجهزة الفردية. قص ورقة الـ PDMS بحيث تكون أكبر قليلاً من الجهاز الموائع الدقيقة. الآن استخدم مثقاب يدوي دقيق (Harris unicorn) أو جهازاً مماثلاً لعمل ثقوب المداخل والمخارج في جهاز الموائع الدقيقة.

بعد ذلك، قم بتنظيف أسطح الجهاز الموائع الدقيقة والرقاقة باستخدام شريط لاصق. ثم استخدم جهاز تنظيف بالبلازما لتعريض أسطح الجهاز الموائع الدقيقة ورقاقة PDMS لبلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية. تخلق بلازما الأكسجين أنواعاً تفاعلية على السطح المكشوف من PDMS، والتي ترتبط عند تلامسها فيزيائياً.

بعد ذلك، قم بملء محقنة سعة 1 مل مزودة بإبرة ذات رأس غير مدبب بقياس 20 gauge بـ 50 µg/mL من الـ Fibronectin المستخلص من بلازما بشرية في PBS، ثم قم بتركيب قطعة من الأنبوب فوق الإبرة. أدخل قطعة من أنبوب أرفع داخل قطعة الأنبوب الأولى لإنشاء تثبيت محكم بالاحتكاك بين قطعتي الأنبوب.

ثم قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب التوصيل الأكثر دقة بمدخل الجهاز الموائع الدقيقة. اضغط على المحقنة لملء القنوات بالكامل بمحلول fibronectin، وتكوين قطرة صغيرة بحجم 100 microliter عند منفذ المخرج لضمان بقاء القنوات رطبة. الآن، قم بتحضين جهاز الموائع الدقيقة في حضانة رطبة عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة تتراوح من 40 إلى 60 دقيقة.

بعد الانتهاء من التحضين، قم بتوصيل محقنة جديدة مملوءة بـ PBS بإبرة ذات طرف غير مدبب. اضغط لدفع PBS لغسل الجهاز الموائع الدقيقة. قم بتحضير من 500,000 إلى 2 مليون خلية لكل ملليلتر من الخلايا البطانية لوريد السرة البشري، أو hve في وسط نمو الخلايا البطانية مع 8% dextran.

تزيد إضافة الديكستران من احتمالية التصاق الخلايا واستزراعها بنجاح داخل الجهاز الموائع الدقيق. املأ محقنة نظيفة مزودة بإبرة ذات سن غير مدبب وأنبوب أوسع بمعلق الخلايا، ثم قم بتوصيل قطعة أطول من الأنابيب يبلغ طولها مترًا واحدًا تقريبًا. من الضروري التأكد من إحكام تركيب الأنابيب لمنع حدوث أي تسرب بين الوصلات.

قم بتعبئة الأنابيب بمحلول الخلايا، مع التأكد من عدم وجود فقاعات في المحقنة أو في أي من الأنابيب لتحسين أداء النظام. من الضروري في هذه المرحلة منع حدوث أي تسرب أو دخول فقاعات إلى النظام؛ حيث إن أي تسرب للمحلول أو وجود فقاعات في الوسط سيعيق التثبيت الناجح للخلايا البطانية.

بمجرد التخلص من جميع الفقاعات وملء كامل طول الأنبوب بمعلق الخلايا، ضع المحقنة على المضخة وقم بتوصيل الطرف الآخر بمدخل الجهاز الموائع الدقيقة. يتم ضبط مضخة المحقنة بحيث تكون على نفس مستوى ارتفاع جهاز الموائع الدقيقة. يتم لف طول الأنبوب الطويل بعناية داخل الحاضنة لضمان تدفئة الخلايا والوسط بدقة قبل ملامستها للجهاز.

بعد ذلك، يتم ضخ معلق الخلايا في الجهاز الموائع الدقيقة بمعدل تدفق حجمي قدره 1.23 µL/min لمدة ساعتين عند 37 °C و5% CO2 في نظامنا. ويقابل معدل التدفق الحجمي البالغ 1.23 µL/min سرعة تيار متوسطة قدرها 1 mm/s في أصغر القنوات. وهذا يقارب إجهاد قص جداري قدره 1 dyne/cm² في تلك القنوات عند استخدام الدم الكامل.

بمجرد اكتمال تسريب معلق الخلايا، استخدم مضخة الحقن نفسها والأنبوب الطويل مع حقنة أكبر لتسريب وسط نمو جديد لمدة تتراوح من يومين إلى ثمانية أيام بمعدل 1.23 microliters per minute. وعندما تصل الطبقة الأحادية من الخلايا إلى مستوى الالتحام المطلوب، يتم حقن الدم أو معلق الخلايا في النظام لإجراء التجارب. يظهر هنا الجهاز الموائع الدقيقة قبل عملية التبطين الغشائي.

تم ملء الجهاز الموائع الدقيقة بصبغة طعام لتوضيح حجم ومقياس والتصميم العام للجهاز الذي يحاكي فسيولوجيا الأوعية الدموية. يُظهر مجهر المجال المضيء عملية تبطين الجهاز الموائع الدقيقة بالخلايا البطانية. تم التقاط هذه الصورة بعد أقل من 48 ساعة من الاستزراع باستخدام البروتوكول الموصوف، حيث تتيح تقنية التروية المُحسّنة للخلايا البطانية أن تنمو بشكل متلاحم لتغطي كامل السطح الداخلي لنظام الموائع الدقيقة.

خلال 24 إلى 48 ساعة من استزراع الخلايا. وكما يظهر في هذه الصورة المجهرية البؤرية، فإن الورم الوعائي الدقيق على شريحة مع قنوات دقيقة يحاكي حجم الأوعية ما بعد الشعيرية الذي يبلغ 30 ميكرون، وهو موقع معظم أحداث الانسداد الوعائي الدقيق في مرض فقر الدم المنجلي. وفي هذه التجربة، يتم ضخ دم كامل من مرضى أصحاء في جهاز أوعية دقيقة على شريحة تحت ظروف خالية من الأكسجين.

يوضح هذا المقطع أن تدفق الدم الكامل في نظامنا الموائع الدقيقة المبطن بالخلايا البطانية هو تدفق منتظم وسلس ومستمر، دون وجود مناطق انسداد في القنوات الدقيقة. وهنا، يتم ضخ دم كامل من مرضى يعانون من فقر الدم المنجلي في جهاز محاكاة للأوعية الدموية الدقيقة على شريحة. وفي ظروف نقص الأكسجين، يُلاحظ حدوث تغيرات كبيرة في تدفق الدم مع وجود انسدادات كاملة في عدة قنوات.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم إدخال فقاعات هواء عند تبديل الأنابيب. الجهاز النهائي متوافق مع المجهر الفلوري ويمكن تكييفه مع مقاييس الفلورة التقليدية. وتمهد هذه التقنية الطريق لأخصائيي أمراض الدم التجريبية لإجراء تجارب باستخدام خلايا مفردة في بيئة بيوفيزيائية وهيموديناميكية محكومة.

بدون فقاعات.