في الوقت الحقيقي التصوير الرقمي من خلايا الدم البيضاء البطاني التفاعل في الإسكيمية-ضخه من الإصابات (IRI) في الجرذان العضلة المشمرة

يعد المجهر الحيوي للأوعية الدموية الدقيقة في عضلة CRE طريقة ملائمة لاكتساب رؤى حول نقص التروية وإصابة إعادة التروية في أنسجة العضلات المخططة. وفي بروتوكول خطوة بخطوة، نوضح كيفية البدء بالتخدير الذي يتم التحكم فيه عن طريق التنفس مع مراقبة كافية عبر القسطرة الشريانية للحفاظ على تخدير الحيوان بشكل ثابت لفترات زمنية أطول. ونبين كيفية إجراء قسطرة الوريد الوداجي، ثم نصف تحضير عضلة CRE كشريحة مسطحة ورقيقة لتحقيق دقة بصرية فائقة.

نقدم بروتوكولاً لتصوير الكريات البيضاء في إصابة تروية نقص التروية وهو بروتوكول تم إرساؤه جيداً في مختبراتنا. يمكن استخدام هذا النموذج لتحليل تأثير الأكسدة في أبحاث إصابة نقص التروية وإعادة التروية.

ترتبط إصابة إعادة التروية بعد نقص التروية بمجموعة واسعة من الحالات المرضية، مثل احتشاء عضلة القلب، ونقص تروية الأمعاء، بالإضافة إلى ما يلي عمليات الزرع وجراحة القلب والأوعية الدموية. إن زيادة تروية الأنسجة التي كانت تعاني من نقص التروية، ورغم ضرورتها لمنع تلف الأنسجة غير القابل للاسترجاع، تؤدي إلى حدوث التهاب مفرط في الأنسجة المتضررة بالتزامن مع إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية، وتنشيط النظام المتمم، وزيادة نفاذية الأوعية الدقيقة. ويعد تنشيط الكريات البيضاء أحد الفاعلين الرئيسيين في الشلال المرضي لتلف الأنسجة الالتهابي أثناء إعادة التروية.

نحن هنا نعزز استخدام المجهر الحيوي داخل الجسم للأوعية الدموية بعد الشعيرية كطريقة مريحة لتحليل تنشيط الكريات البيضاء في إصابة نقص التروية وإعادة التروية. كما نوضح العثرات الشائعة ونقدم نصائح مفيدة من شأنها أن تمكن القارئ من تقدير هذه الطريقة وتنفيذها بأمان. بعد الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات وتخدير ذكور جرذان مألوفة يتراوح وزن أجسامها بين 120 إلى 180 جرامًا، وُضع الجرذ داخل صندوق من البلكسي جلاس وتم إعطاؤه ما يتراوح بين 2 إلى 3 % حجمياً من الإيزوفلوران عبر مبخر الإيزوفلوران.

بمجرد الوصول إلى المستوى المناسب من التخدير، يتم وزن الجرذ وحلاقة المنطقة الرقبية البطنية. يوضع الجرذ في وضعية الاستلقاء الظهري على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 degrees Celsius، ويُطبق isoflurine بنسبة 2% حجماً باستخدام قناع سيليكون. ومن الأفضل إجراء التحضيرات التالية باستخدام مجهر جراحي.

قم بإجراء شق جلدي أفقي بطول سنتيمترين في منطقة الثلمة القصية لـ SRAs. قم بإزاحة الغدد اللعابية جانبياً. ستظهر لك الآن عضلات الرقبة البطنية.

افصلهم بعناية في الخط المتوسط وحدد موقع الرغامي. اكشف عن واحد إلى اثنين سنتيمتر من الرغامي وضع ملقطاً دقيقاً من الأسفل لرفعه. الآن، في منتصف الجانب البطني للرغامي تقريباً، أدخل أنبوباً بقياس 14 gauges كأنبوب رغامي في الجزء السفلي من الرغامي، والذي تم توصيله مسبقاً بجهاز تهوية حيواني.

يمكن بعد ذلك التحكم في التنفس عن طريق التحكم في الحجم بتردد يتراوح من 35 إلى 45 نفساً في الدقيقة. ويُستخدم حجم مدّي يتراوح من 4.5 إلى 5 mL وتركيز من الـ ISO fluorine يتراوح من 1.5 إلى 2% حجماً لعملية قسطرة الشريان السباتي. يتم فصل العضلة اللامية القصية اليمنى عن طريق التشريح غير الحاد.

لتحديد موقع الشريان السباتي، افصل العصب المبهم بعناية عن الشريان السباتي ثم ثبّت الشريان باستخدام ملقط دقيق من نوع Anki لوقف تدفق الدم من القلب، وذلك عبر وضع خيطين جراحيين أسفل الشريان السباتي بالنسبة لموقع القلب؛ حيث يتم ربط الخيط الجراحي القاصي بإحكام، بينما يُربط الخيط الجراحي الداني بشكل فضفاض حول الشريان السباتي. ويمنع تطبيق خيط جراحي داني ثانٍ حدوث نزيف بعد إزالة الملقط الدقيق، وذلك باستخدام مقص دقيق لإجراء قطع صغير في الشريان السباتي بين الربطتين. ثم أدخل قسطرة من البولي إيثيلين مملوءة بمحلول ملحي طبيعي ومتصلة بمحول ضغط.

قم بإزالة الملاقط الدقيقة ومرر القسطرة بشكل أعمق داخل الشريان. أجرِ تحليلاً متقطعاً لغازات الدم الشرياني باستخدام جهاز تحليل غازات الدم، وحافظ على الرقم الهيدروجيني (pH) للدم ضمن الحدود الفسيولوجية للتطبيق الوريدي للأصباغ الفلورية أو العقاقير الأخرى المطلوبة. ركز باستخدام المجهر الجراحي على منطقة الوريد الوداجي الأيسر مع إمساك ملاقط في كل يد، ثم مزق اللفافة الرقيقة للكشف عن الوريد الوداجي.

ثبّت الوريد باستخدام ملقط دقيق مائل لإيقاف تدفق الدم. وباستخدام الملقط، يتم تمرير قطعتين متساويتي الطول من خيط الجراحة تحت الوريد الوداجي بطريقة مماثلة لعملية قسطرة الشريان السباتي، ثم اصنع شقاً صغيراً في الوريد الوداجي وأدخل قسطرة بولي إيثيلين سبق شطفها بمحلول الخط الخلوي. مرر القسطرة باتجاه القلب وأحكم ربط الرباط الأقرب إلى القلب.

نستخدم حول الوريد والقثطرة منصة تصوير كرمسترية من الألومنيوم من الدرجة الرابعة، والتي تتبنى بسرعة درجة الحرارة المطلوبة للوسادة الحرارية. يتم إجراء الشق الأولي في الجلد والغلالة المنوية الخارجية فوق الصفن في الطرف البعيد جداً، يلي ذلك توسيع حذر للمساحة تحت الجلد باستخدام مقصات دقيقة. وبمجرد كشف الأنسجة، يتم ترطيبها بمحلول ملحي مسخن مسبقاً.

تتم إزالة النسيج الضام الموجود بين اللفافة المنوية الخارجية والعضلة المسرّبة (CRE master muscle) بعناية لتحرير العضلات الثلاثية من الأنسجة المحيطة. ويؤدي الإرواء المستمر أثناء التشريح إلى ترطيب النسيج، مما يسهل الرؤية والإزالة، مثل الطرف القاصي لـ CRE master S لتثبيت وتمديد نهاية S قليلاً داخل الطرف القاصي للكيس من الجانب البطني وإطالة الشق في الاتجاه الداني. وباستخدام مقصات دقيقة، يتم كي الأوعية الدموية النازفة بعناية على طول خطوط الشق.

باستخدام ملقط حراري، توضع العضلة الرافعة للخصية المفتوحة بشكل مسطح على قاعدة الألومنيوم، مع بقائها متصلة بأربطة رفيعة بـ EPIs الموجودة أسفل الخصية، بما في ذلك شريان ووريد صغيران. استخدم الملقط الحراري لكي الأوعية الدموية وقطع الأربطة الضامة بين النسيج القرصي ونسيج العضلة الرافعة للخصية. ادفع الخصية المعزولة برفق إلى القناة الإربية.

بالإضافة إلى التثبيت الأول، والذي يتكون من أربع غرز في النسيج، ثبت الخيوط بحذر ثم افرد النسيج الكريمستري (cremasteric tissue) شعاعياً على المنصة الألومنيوم. ضع طرفين من قسطرة البولي إيثيلين بالقرب من نسيج الكريمستر لتهيئة نظام التروية السطحية (superfusion setup). ارسم خطاً من هلام البترول حول عضلة الكريمستر باستخدام سرنجة لإنشاء غرفة للسوائل.

ضع غطاءً زجاجياً مربعاً فوق النسيج، وثبّت الحواف بإحكام عند خط الفازلين. أصبح النسيج العضلي للخصية الآن جاهزاً للتصوير المجهري. قد يختلف الإعداد الأساسي للتصوير الحي داخل الجسم.

نستخدم مجهر فلورية فوقي حيوي مزوداً بمصدر ضوئي LED بطول موجي 470 nanometer لتصوير طبقات الـ EP. وباستخدام عدسة شيئية غاطسة في الماء، نحقق تكبيراً يبلغ حوالي 800x لتسجيل الملاحظات بواسطة كاميرا رقمية عالية الدقة. ومن أجل التصوير بالفلورية الفوقية، يجب إجراء التجربة في غرفة مظلمة.

لتوسيم الكريات البيضاء، احقن rumine six J وريدياً عبر القسطرة الوداجية بتركيز 0.4 milligram لكل kilogram من وزن الجسم. اختر وريداً ما بعد الشعيرات الدموية للملاحظة، على أن يتراوح قطر الوعاء بين 20 إلى 60 micrometer مع ضمان تدفق دم كافٍ.

قبل حدوث نقص التروية (Ischemia)، اترك الأنسجة تستقر لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بإجراء تسجيل لمدة 30 ثانية لتحديد القيم الأساسية لتدحرج وكريات الدم البيضاء والتصاقها. ضع مشبك وعاء bemer برفق حول الطرف القريب جداً من نسيج العضلة الكريمسترية المكشوف باستخدام ملاقط التطبيق.

قم بإزالة مشبك الوعاء بعد 30 دقيقة من نقص التروية (isch). ويمكن إجراء تسجيلات لاحقة طوال فترة إعادة التروية. ولتقدير كمية تدحرج الكريات البيضاء، حدد خطاً افتراضياً يقطع الوعاء رأسياً، بحيث يكون ثابتاً في جميع التسجيلات.

قم بعدّ عدد الكريات البيضاء المتدحرجة التي تعبر الخط يدوياً خلال 30 ثانية. ولتقدير كمية الكريات البيضاء الملتصقة، حدد مقطعاً وعائياً بطول 200 micrometer يكون ثابتاً في جميع السجلات.

قم بعدّ عدد الكريات البيضاء المرئية بوضوح والتي تظل ثابتة خلال 30 ثانية. تتوفر النتائج النموذجية ضمن البروتوكول المكتوب. ورغم أن إصابة نقص التروية وإعادة التروية قد ارتبطت بأنظمة أعضاء مختلفة، فإننا نصف هنا طريقة لتحليل التفاعل بين الكريات البيضاء والبطانة الغشائية في إصابة إعادة التروية لأنسجة العضلات المخططة.

وبالتالي، فإن هذا الأمر ذو صلة وثيقة بجراحة السديلة، حيث يُفترض أن إصابة الأنسجة التالية لنقص التروية في الأعضاء الأخرى تنطوي على الآليات الالتهابية ذاتها. ويمكن استخدام الطريقة الموصوفة لاكتساب رؤى أساسية حول الآليات المرضية في إصابة الاندماج الناتجة عن نقص التروية. كما يمكن تطبيق نقص التروية على العضلة الرافعة للخصية بسهولة، وهو ما يعكس بدقة الظروف ذات الصلة سريرياً مثل جراحة السديلة الحرة.

علاوة على ذلك، يمكن تطبيق تعديلات بسهولة مثل نقص تروية البارد أو نقص تروية الدافئ أو الإرواء السطحي الكروموسومي بمواد تؤثر على الالتهاب. وقد يكون الحقن داخل الفم هو الطريقة المفضلة عندما يكون العلاج مطلوباً قبل ساعات أو أيام من التسجيل.