في الوقت الحقيقي التصوير الرقمي من خلايا الدم البيضاء البطاني التفاعل في الإسكيمية-ضخه من الإصابات (IRI) في الجرذان العضلة المشمرة

يعد الفحص المجهري الحيوي للدورة الدموية الدقيقة في عضلة CRE وسيلة ملائمة لاكتساب رؤى حول نقص التروية وإصابة إعادة التروية في أنسجة العضلات المخططة. في بروتوكول مفصل خطوة بخطوة، نوضح كيفية البدء بالتخدير تحت التحكم في التنفس مع مراقبة كافية عبر القسطرة الشريانية للحفاظ على تخدير الحيوان بشكل ثابت لفترات زمنية طويلة. كما نبين كيفية إجراء قسطرة الوريد الوداجي، ثم نصف تحضير عضلة CRE كصفيحة رقيقة ومسطحة لتحقيق دقة بصرية فائقة.

نقدم بروتوكولاً لتصوير الكريات البيضاء في إصابة تروية نقص التروية التي تم إثبات فعاليتها في مختبراتنا. يمكن استخدام هذا النموذج لتحليل تأثير الأكسدة في أبحاث إصابة تروية نقص التروية.

ترتبط إصابة إعادة التروية بعد نقص التروية بمجموعة واسعة من الحالات المرضية، مثل احتشاء عضلة القلب، ونقص تروية الأمعاء، وكذلك الحالات التي تلي عمليات الزراعة وجراحات القلب والأوعية الدموية. إن زيادة تروية الأنسجة التي كانت تعاني من نقص التروية، رغم أهميتها القصوى لمنع حدوث إصابة نسيجية غير قابلة للانعكاس، فإنها تسبب التهاباً مفرطاً في الأنسجة المصابة بالتزامن مع إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية، وتنشيط النظام المتمم، وزيادة نفاذية الأوعية الدموية الدقيقة. ويعد تنشيط الكريات البيضاء أحد الفاعلين الرئيسيين في الشلال المرضي للتلف النسيجي الالتهابي أثناء إعادة التروية.

نقدم هنا تقنية المجهر الحيوي للأوعية ما بعد الشعيرية كطريقة ملائمة لتحليل تنشيط الكريات البيضاء في إصابة نقص التروية وإعادة التروية. كما نوضح الأخطاء الشائعة ونقدم نصائح مفيدة من شأنها أن تمكن القارئ من تقدير هذه الطريقة وتنفيذها بأمان. بعد الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات وتخدير ذكور جرذان وزن الجسم فيها يتراوح بين 120 إلى 180 جراماً، يتم وضع الجرذ داخل صندوق من البلكسي جلاس وإعطاؤه تركيزاً يتراوح بين 2 إلى 3% من مادة iso florine عبر مبخر iso florine.

بمجرد الوصول إلى المستوى المناسب من التخدير، يتم وزن الجرذ وحلاقة منطقة الرقبة البطنية. يتم وضع الجرذ في وضعية الاستلقاء الظهري على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 °C وتطبيق isoflurane بنسبة 2% من الحجم باستخدام قناع سيليكون. يُفضل إجراء التحضيرات التالية باستخدام مجهر جراحي.

قم بإجراء شق جلدي أفقي بطول سنتيمترين في منطقة الثلمة القصية لـ SRAs. قم بإزاحة الغدد اللعابية جانبيًا. ستظهر لك الآن عضلات الرقبة البطنية.

افصلهما بعناية في الخط الناصف وحدد موقع الرغامي. اكشف عن سنتيمتر واحد إلى اثنين من الرغامي وضع ملقطاً دقيقاً من الأسفل لرفعه. والآن، في منتصف الجانب البطني من الرغامي تقريباً، أدخل أنبوباً بمقاس 14 gauge كأنبوب رغامي في الجزء السفلي من الرغامي، والذي يكون قد تم توصيله مسبقاً بجهاز تنفس اصطناعي للحيوانات.

يمكن بعد ذلك التحكم في التنفس عن طريق التحكم في الحجم بتردد يتراوح من 35 إلى 45 نفساً في الدقيقة. مع حجم مدّي يتراوح من 4.5 إلى 5 mL وتركيز ISO fluorine يتراوح من 1.5 إلى 2% حجماً لإجراء قسطرة الشريان السباتي. يتم فصل العضلة اللامية القصية اليمنى عن طريق التشريح الثلم.

لتحديد موقع الشريان السباتي، افصل العصب المبهم بعناية عن الشريان السباتي وثبّت الشريان باستخدام ملقط مجهري من نوع Anki لإيقاف تدفق الدم من القلب عبر ربط قطعتين من خيوط الجراحة أسفل الشريان السباتي بالنسبة لموقع القلب، بحيث تُربط الخياطة القاصية بإحكام، بينما تُربط الخياطة الدانية بشكل فضفاض حول الشريان السباتي. يمنع وضع خياطة دانية ثانية حدوث نزيف بعد إزالة الملقط المجهري، حيث يتم إجراء قطع صغير في الشريان السباتي بين الربطتين باستخدام مقص مجهري. أدخل قسطرة بولي إيثيلين مملوءة بمحلول ملحي طبيعي ومتصلة بمحول قياس الضغط.

أزِل الملقط الدقيق ومرر القسطرة بشكل أعمق داخل الشريان. أجرِ تحليلاً متقطعاً لغازات الدم الشرياني باستخدام محلل غازات الدم، وحافظ على درجة حموضة الدم (pH) ضمن الحدود الفسيولوجية عند التطبيق الوريدي للأصباغ الفلورية أو أي عقاقير أخرى مطلوبة. ركز بالمجهر الجراحي على منطقة الوريد الوداجي الأيسر مع الإمساك بملقط في كل يد، ثم مزق اللفافة الرقيقة للكشف عن الوريد الوداجي.

ثبّت الوريد باستخدام ملقط دقيق مائل لإيقاف تدفق الدم. وباستخدام الملقط، يتم تمرير قطعتين متساويتي الطول من خيط جراحي تحت الوريد الوداجي بأسلوب مماثل لعملية كانيولير الشريان السباتي، ثم يتم إجراء قطع صغير في الوريد الوداجي وإدخال قسطرة بولي إيثيلين تم غسلها بمحلول الخط الخلوي. مرّر القسطرة باتجاه القلب ثم أحكم ربط الرباط الأقرب إلى القلب.

نستخدم حول الوريد والقسطرة منصة تصوير للمصرة من الألومنيوم من الدرجة الرابعة، والتي تكتسب بسرعة درجة الحرارة المطلوبة من وسادة التسخين. يتم إجراء الشق الأولي في الجلد والغشاء الصفنوي الخارجي فوق الصفن في الطرف البعيد جداً، يليه توسيع حذر للمساحة تحت الجلد باستخدام مقصات دقيقة. وبمجرد ظهور الأنسجة، يتم ترطيبها بمحلول ملحي مسخن مسبقاً.

يتم إزالة النسيج الضام الموجود بين اللفافة المنوية الخارجية والعضلة المرفاعة للخصية (CRE master muscle) بعناية لتحرير العضلات من الأنسجة المحيطة بها. يعمل الإرواء المستمر أثناء التشريح على ترطيب النسيج، مما يسهل الرؤية والإزالة، مثل الطرف القاصي من العضلة المرفاعة للخصية لتثبيت وتمديد نهاية العضلة قليلاً داخل الطرف القاصي للكيس من الناحية البطنية وإطالة الشق باتجاه القريب. وباستخدام مقصات جراحية دقيقة، يتم كي الأوعية الدموية النازفة بعناية على طول خطوط الشق.

باستخدام ملقط حراري، يتم وضع عضلة الرفع المفتوحة بشكل مسطح على قاعدة pedestal من الألومنيوم، مع بقائها متصلة بأربطة رفيعة بالـ EPIs الموجودة أسفل الخصية، بما في ذلك شريان ووريد صغيران. استخدم الملقط الحراري لكي الأوعية الدموية ولقص الأربطة الضامة بين الأنسجة القرصية وعضلة الرفع. ادفع الخصية المعزولة برفق إلى القناة الإربية.

بالإضافة إلى التثبيت الأول، وهو عبارة عن أربع غرز في النسيج، وبثبت الخيوط بحذر، قم بفرد النسيج العضلي المساريقِي (cremasteric tissue) شعاعياً على المنصة الألومنيوم. ضع طرفي قسطرة البولي إيثيلين بالقرب من نسيج العضلة المساريقية لإعداد عملية التروية السطحية. ارسم خطاً من هلام البترول حول العضلة المساريقية باستخدام حقنة لإنشاء غرفة للسوائل.

ضع غطاء شريحة مربعاً فوق النسيج، وثبّت الحواف بإحكام على خط الفازلين. أصبح النسيج العضلي للمنطقة الإربية الآن جاهزاً للتصوير المجهري. قد يختلف الإعداد الأساسي للتصوير الحي داخل الجسم.

نستخدم مجهراً فلورياً فوقياً حياً مزوداً بمصدر ضوئي LED بطول موجي 470 nanometer من أجل تصوير الطبقات الخارجية (EP lamination). وباستخدام عدسة شيئية غاطسة مائية، نحقق تكبيراً يبلغ 800 x تقريباً وتسجيلاً للملاحظات بواسطة كاميرا رقمية عالية الدقة. وللحصول على صور الفلورية الفوقية، يجب إجراء التجربة في غرفة مظلمة.

لتوسيم الكريات البيضاء، احقن rumine six J وريدياً عبر قسطرة الوريد الوداجي بتركيز 0.4 milligram لكل kilogram من وزن الجسم. اختر وريداً ما بعد شعيري للمراقبة، بحيث يتراوح قطر الوعاء بين 20 إلى 60 micrometer مع ضمان تدفق دم كافٍ.

قبل حدوث نقص التروية، اترك النسيج ليستقر لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بإجراء تسجيل لمدة 30 ثانية لتحديد القيم الأساسية لتدحرج الكريات البيضاء والتصاقها. ضع مشبك وعاء بيمر برفق حول الطرف القريب جداً من نسيج العضلة المرفاعة المكشوف باستخدام ملقط التطبيق.

قم بإزالة مشبك الوعاء بعد 30 دقيقة من نقص التروية (isch). ويمكن إجراء تسجيلات لاحقة طوال فترة إعادة التروية. ولقياس تدحرج الكريات البيضاء، حدد خطاً افتراضياً يتقاطع مع الوعاء رأسياً، بحيث يكون ثابتاً في جميع السجلات.

قم بعدّ عدد الكريات البيضاء المتدحرجة التي تعبر الخط يدوياً خلال 30 ثانية. ولتقدير كمية الكريات البيضاء الملتصقة، حدد مقطعاً وعائياً بطول 200 ميكرومتر يكون ثابتاً في جميع السجلات.

قم بعدّ عدد كريات الدم البيضاء المرئية بوضوح والتي تظل ثابتة لمدة 30 ثانية. تتوفر النتائج التمثيلية ضمن البروتوكول المكتوب. وعلى الرغم من تورط إصابة نقص التروية وإعادة التروية في أنظمة أعضاء مختلفة، فإننا نصف هنا طريقة لتحليل التفاعل بين كريات الدم البيضاء والخلايا البطانية في إصابة إعادة التروية في أنسجة العضلات المخططة.

وبذلك، تكتسب هذه الدراسة أهمية خاصة في جراحات السديلة، حيث يُفترض أن إصابة الأنسجة التالية لنقص التروية في الأعضاء الأخرى تتضمن الآليات الالتهابية ذاتها. ويمكن استخدام الطريقة الموصوفة لاكتساب رؤى أساسية حول الآليات المرضية في إصابات اندماج نقص التروية. كما يمكن تنفيذ تطبيق نقص التروية على العضلة الكريمسترية بسهولة، وهو يحاكي تماماً الظروف ذات الصلة سريرياً مثل جراحة السديلة الحرة.

علاوة على ذلك، يمكن تطبيق تعديلات مثل نقص التروية البارد أو نقص التروية الدافئ أو الإرواء السطحي الكروموسومي بمواد تؤثر على الالتهاب بسهولة. قد يكون الحقن داخل الفم هو الطريقة المختارة عندما تكون المعالجة مطلوبة قبل ساعات أو أيام من التسجيل.