نانو FEM: تعريب البروتين عن طريق الصور التي تنشط المجهر التعريب والمجهر الإلكتروني

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد مواقع البروتينات والصور المجهرية الإلكترونية باستخدام المجهر الفلوري والإلكتروني المترابط. تُستخدم هذه الطريقة، المعروفة باسم nano FEM، لتحديد مواقع البروتينات في دودة C elgan. أولاً، يتم دمج دودة معدلة وراثياً تعبر عن histone TD eos في البلاستيك ثم يتم تقطيعها إلى شرائح.

يتم تصوير كل مقطع باستخدام كل من مجهر التوطين الضوئي المنشط (PALM) والمجهر الإلكتروني الماسح. ويتم محاذاة المجهريتين لكل مقطع باستخدام علامات مرجعية بواسطة برنامج Photoshop. وتوضح الصورة الارتباطية توطن جزيئات الهيستون في النواة.

لذا فإن الميزة الرئيسية للتقنية التي سنقوم بشرحها اليوم هي أننا نستخدم الفلورات المرمزة جينياً بدلاً من المجهر الإلكتروني المناعي (immuno EM)، بحيث يكون كل بروتين مرتبطاً ببروتين فلوري. فعند التعامل مع المجهر الإلكتروني المناعي، لا يمكن للعديد من الأجسام المضادة التفاعل مع البلاستيك نظراً لعدم التوافق، وحتى في حال توافقها، لا تستطيع الأجسام المضادة التغلغل بعمق في المقطع حيث توجد المستضدات.

من خلال استخدام البروتينات الفلورية، يتم وسم كل بروتين بفلوروفور. لذا سيقوم shige wbi اليوم بشرح هذه التقنية. سيتم توضيح الإجراء التالي باستخدام ديدان خيطية معدلة وراثياً تعبر عن هيستونات موسومة بالبروتين الفلوري TDE os.

لهذا العرض التوضيحي، سنستخدم البكتيريا كمادة واقية من التجمد، ولكن يمكنكم أيضاً استخدام 20%BSA لتجميد sea elegance. قبل ساعة واحدة من عملية الاستبدال بالتجميد، املأ جهاز الاستبدال بالتجميد الآلي أو جهاز FS بالنيتروجين السائل. كما يجب تحضير المثبتات المطلوبة مسبقاً وفقاً للتعليمات الواردة في الوثيقة المرفقة، وتخزين المثبتات في حصص قدرها 1 mL في أنابيب تجميد (cryo vials)، ووضعها في النيتروجين السائل حتى وقت استخدامها.

استخدم فرشاة رسم لغرف الحيوانات من مستعمرة بكتيرية ونقلها لملء حامل عينات بسعة 100 ميكرون. املأ الكوب بزيادة طفيفة لضمان عدم وجود فقاعات هوائية. بمجرد الانتهاء، ضع كوب العينة في ذراع جهاز التجميد عالي الضغط لتجميده. ثم انقل العينة فوراً إلى حمام من النيتروجين السائل بجوار غرفة التجميد.

بعد ذلك، وباستخدام ملقط وزوج من الملاقط، انقل العينة إلى أنبوب تجميد يحتوي على مثبتات. تأكد من بقاء العينة مغمورة في النيتروجين السائل في جميع الأوقات. كرر هذه العملية لكل عينة، ثم انقل جميع أنابيب التجميد إلى وحدة FS.

بمجرد وضع جميع أنابيب الحفظ بالتجميد في وحدة FS، ابدأ البرنامج. يوضح هذا المخطط بروتوكول التجميد والمعالجة. خلال فترة الحضانة الأولية عند درجة حرارة 90- °C، يتم استبدال الجليد الزجاجي بالمثبت الموجود في الأسيتون.

بعد ذلك، ومع ارتفاع درجة حرارة العينة، يعمل المثبت الموجود في الأسيتون السائل على ربط العينة تشابكياً للحفاظ على بنيتها. عندما تصل درجة الحرارة في وحدة FS إلى 60- درجة مئوية، ضع قوارير الومضان التي تحتوي على 20 milliliters من 95%acetone في وحدة FS لتبريدها. ثم عند وصول درجة الحرارة إلى 50- درجة مئوية، استخدم ماصة باستور مع طرف P 200 لإزالة المثبت وإضافة حوالي 1 milliliter من 95%acetone المبرد مسبقاً إلى كل عينة من الصفراء.

كرر هذه العملية كل 20 دقيقة على مدار ساعتين. وأيضاً، خلال فترة الحضن عند درجة حرارة 50- °C، ضع قارورة وميض تحتوي على 20 milliliters من 0.1%urinal acetate في 95%acetone داخل غرفة الـ FS لتبريدها مسبقاً إلى 50- °C. ثم بعد غسلة الأسيتون النهائية، أضف حوالي one milliliter من محلول urinal acetate إلى كل قارورة لصبغ العينة بهدف تعزيز تباين الغشاء.

إذا تم إيقاف البرنامج مؤقتًا، فقم بإعادة تشغيله. عندما تصل درجة الحرارة إلى 40- °C، ضع قوارير الوميض التي تحتوي على 95% ethanol في غرفة FS. وعندما تصل درجة الحرارة إلى 30- °C، استخدم ماصة باستور لاستبدال خلات البول بـ 95% ethanol كل 20 دقيقة لمدة ساعتين.

من المهم استخدام الإيثانول في هذه الخطوة لأن الراتنج لن يتبلمر في وجود الأسيتون. وفي الجزء التالي من البروتوكول، يتم تضمين العينات في البلاستيك بينما تكون العينات عند درجة حرارة 30- °C. في جهاز FS، استبدل الـ 95% ethanol بـ 30% glycol methacrylate resin أو GMA المبرد مسبقاً في 95% ethanol؛ وبعد مرور ثلاث إلى خمس ساعات، استبدل الـ 30% GMA بـ 70% GMA؛ وبعد أربع إلى ست ساعات، قم بإزالة الـ 70% GMA واحضن العينات في 97% GMA طوال الليل.

تسمح الزيادة التدريجية في تركيز GMA بتغلغل الوسائط داخل الأنسجة. لاحظ أنه بما أنه تمت إضافة 3% من الماء إلى راتنج GMA، فإن تركيز 97%GMA لا يتم تخفيفه. وفي اليوم التالي باستخدام الإيثانول، انقل العينات إلى قالب التضمين في A FS باستخدام ماصة باستور، ثم ضع العينات في قالب التضمين واستبدل 97%GMA بـ GMA مُحضّر حديثاً ثلاث مرات على مدار ست ساعات عند درجة حرارة minus 30 degrees celsius.

بعد عملية التبادل الثالثة، انقر على مصفوفة البكتيريا لفصل العينة عن مادة الحماية من التجميد. أضف البادئ nn dimethyl udine إلى 97%GMA في قارورة تهوية. تكون كمية البادئ المضافة 1.5 µL لكل 1 mL من GMA؛ ثم أضف محلول GMA فوراً إلى كل قالب تضمين وقم بتوزيع الحيوانات داخل القالب بحيث تكون متباعدة بشكل متساوٍ.

أعد تشغيل البرنامج بحيث ترتفع درجة الحرارة إلى -20 درجة مئوية. وعلى الرغم من أن الراتنج يتبلمر بسرعة في غضون ساعة واحدة، اترك البلاستيك ليتقسى طوال الليل عند -20 درجة مئوية، وذلك للتأكد من تبلمره تماماً.

بمجرد أن يتصلب البلاستيك، تُحفظ العينة في كيس تفريغ مملوء بغاز النيتروجين عند درجة حرارة -20 °C. بعد ذلك، يتم إجراء تقطيع العينة المدمجة في GMA كما هو موضح في المستند المرفق الخاص بمجهر التوطين المنشط ضوئياً (PALM imaging). يجب إعداد نظام المجهر بحيث يتم ضبط كاميرا E-M-C-C-D على درجة حرارة -70 °C أو أقل.

باستخدام الماصة، ضع حوالي 50 µL من جزيئات الذهب بحجم 100 nm وبتركيز 1 × 10¹⁰ جزيء/mL في محلول على العينة المراد تصويرها. ضع غطاءً أسود فوق العينات واترك المحلول لمدة 30 ثانية على غطاء الشريحة. ولإزالة محلول الذهب، ادفعه بالنفخ إلى حافة غطاء الشريحة ثم امتص المحلول باستخدام منديل كيم وايب (Kim wipe).

بعد ذلك، ضع شحم التفريغ على حامل شريحة غطاء دائرية وأدخل شريحة الغطاء. ضع زيت الغمر على الجانب السفلي من الغطاء. ثم مرره مباشرة أسفل العينة.

أدخل حامل العينة في الفتحة الموجودة على منصة المجهر وقم بتعديله بحيث يكون محكمًا ومتمركزًا بحيث تقع المقاطع فوق العدسة الشيئية. توخَّ الحذر الشديد لتجنب لمس العدسات الشيئية. بعد ذلك، وباستخدام إضاءة المجال المضيء، حدد موقع المقاطع باستخدام عدسة شيئية بقوة 10 x.

بعد ذلك، انتقل إلى العدسة الشيئية 100x وقم بضبط التركيز على العينة. إذا لزم الأمر، قم بالتحويل إلى الإضاءة الفلورية باستخدام ليزر 488 nanometer مع ضبط الشدة عند 10%. انتظر مرور خمس دقائق حتى تتوازن درجة حرارة العينة. ثم حدد المناطق ذات الفلورة الأكثر سطوعاً وقم بضبط التركيز عليها.

قم بتحويل الليزرات إلى 561 nanometers وزد الشدة إلى 100%. ولإزالة الفلورة الذاتية للخلفية، قم بتبييض العينة لمدة دقيقتين تقريبًا. إذا تغير التركيز أثناء التبييض، انتظر مرور خمس دقائق قبل ضبط التركيز والتقاط الصور. عند اكتمال التبييض، قم بتنشيط الليزر 405 nanometer واضبطه على أدنى شدة.

ابدأ في جمع الصور بمعدل 20 إطاراً في الثانية. اجمع عدداً كافياً من الإطارات لتحقيق هدف التجربة هنا. يتم التقاط ما بين 5,000 إلى 6,000 إطار لتحديد تموضع بروتينات histone 584 داخل النواة.

بمجرد جمع 5, 000 إطار، يتم تحديد جميع الجزيئات ورسم خرائطها بواسطة برنامج التصوير. وتكون صورة الفلورة النهائية، أو ما تسمى بصورة some turf، عبارة عن صورة مركبة لجميع الفلورة التي تم اكتشافها بواسطة الكاميرا. وفي المقابل، تقوم صورة palm برسم خرائط لـ OID لكل بقعة فلورية وتوضح فقط موقع كل بروتين.

قبل التصوير باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)، قم بصبغ المقاطع باستخدام 2.5%urinal acetate في الماء لمدة أربع دقائق. اغسل الـ urinal acetate جيداً باستخدام ماء milli QE المفلتر. بعد جفاف المقاطع، استخدم جهاز الترسيب (sputter) لطلاء شريحة التغطية بالكربون حتى تصبح داكنة إلى حد ما.

ضع شريطاً كربونياً موصلاً عند حافة الغطاء الزجاجي من أحد الطرفين وعلى القاعدة المعدنية من الطرف الآخر، وذلك لضمان تأريض الإلكترونات التي تتراكم على سطح الغطاء الزجاجي. قم بتركيب الغطاء الزجاجي في غرفة المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) وحدد موقع العينة في المجهر. التقط صورة للعينة بتكبير منخفض، ثم قم بالتكبير في المنطقة المستهدفة للحصول على صور عالية التكبير.

كرر هذه العملية مع مقطع جديد حتى يتم تصوير جميع المقاطع. بعد ذلك، يجب محاذاة صور palm وصور EM. وللقيام بذلك، ابدأ بفتح صور SEM المكتسبة في برنامج Photoshop.

قم بإنشاء نافذة جديدة بأبعاد 5,000 في 5,000 بكسل وبدقة 300 بكسل لكل بوصة. انسخ صورة SEM بتكبير التحميل إلى النافذة الجديدة. استخدم أمر التحويل الحر (free transform) الموجود في قائمة التحرير (edit) لتغيير مقياس الصورة بحيث تملأ النافذة بالكامل.

بعد ذلك، قم بنسخ صور المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) ذات التكبير الأعلى، ثم قم بتغيير المقياس والتحويل حسب الضرورة. اختر تدوير الصورة من شريط القائمة المنسدلة للصور، وقم بقلب صورة السطح الإجمالية أفقيًا. انسخ صورة السطح الإجمالية والصقها في طبقة جديدة.

استخدم أمر التحويل الحر (free transform) الموجود في قائمة تحرير (edit) لتغيير مقياس الصورة بحيث تصبح تقريبًا بنفس حجم الصورة المجهرية الإلكترونية ذات التكبير المنخفض. ثم قم بتدوير الصورة حسب الضرورة لمطابقة فلورية جزيئات الذهب مع الهياكل المقابلة لها التي تظهر في المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). بعد ذلك، انسخ صورة الراحة في طبقة جديدة وقم بتطبيق نفس التحويل لاستخراج صورة ذات تكبير أعلى.

قم بالتكبير في المنطقة ذات الأهمية وانسخ صورة السعفة من تلك المنطقة. الصق الصورة في صورة SEM ذات دقة أعلى من أجل العرض. يجب تطبيق شفافية متدرجة على صورة السعفة بحيث تصبح الخلفية السوداء فقط شفافة، بينما تظل إشارات السعفة غير شفافة.

انسخ صورة كف اليد المحولة إلى طبقة جديدة. حدد إشارات كف اليد دون الخلفية باستخدام خيار "color range" من القائمة المنسدلة "select". بعد ذلك، اختر بكسل من الخلفية كمرجع وقم بتفعيل خيار العكس "invert".

قم بقص إشارات الراحة المطلوبة ولصقها في طبقة جديدة. قم بتطبيق الشفافية على طبقة الخلفية واضبطها على 10%، مما يسمح بتصور إشارات الراحة من خلال جعل الخلفية شفافة دون المساس بالشدة. بروتين الهيستون.

تم التعبير عن His 11 tagged TD eos بشكل مستقر في الدودة الخيطية c elgan، وتمت معالجة الحيوانات المعدلة وراثياً وتصويرها باستخدام البروتوكول الموضح في هذا الفيديو. تم الحصول على الصور المجهرية الفلورية والإلكترونية من المقطع نفسه. ثم استُخدمت جسيمات الذهب النانوية، التي تظهر في كل من الصور المجهرية الفلورية والإلكترونية، لمحاذاة الصورتين.

نقوم هنا بتكبير منطقة بالقرب من الطرف العلوي للصورة المجهرية. وكما يتضح هنا، تظهر تفاصيل تحت خلوية مثل النواة.

يمكن ملاحظة النواة، والمسام النووية، والشبكة الإندوبلازمية. ومع ذلك، فإن جزيئات الهيستون الموّسمة تتمركز حصرياً في النواة، وليس في النواة. وكما هو متوقع، فإن المجهر الإلكتروني ومجهر PALM الارتباطي يسمحان بتحديد موقع البروتين بأعلى دقة ممكنة. وبعد تنفيذ هذا الإجراء، يمكن أخذ هذه المقاطع التي توضح توزيع البروتين وتكديسها باستخدام التصوير المقطعي المصفوفي (array tomography) بحيث يمكنك إنشاء بنية ثلاثية الأبعاد، توضح أماكن توزيع البروتينات في الخلية.

وتذكر أن استخدام رباعي أكسيد الأوزميوم ينطوي على التعامل مع مادة كيميائية خطيرة جداً، لذا يجب عليك دائماً ارتداء القفازات.