جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد الفئران البالغة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، أو I PSCs عن طريق تكميل الجنين رباعي الصبغيات. يتم تحقيق ذلك من خلال الوصول أولا. I PSCs من الخلايا الليفية الجنينية للفأر باستخدام فيروسات العدسية ، تحمل OCT أربعة ، SOX اثنين ، KLA أربعة و CMIC وتكملة الوسائط بحمض الفالبرويك أو VPA.

بمجرد إنشاء IPCs ، فإنها تتميز بالتلوين المناعي وعد الكروموسومات وتكوين جسم الجنين. تتمثل الخطوة التالية في توليد مساعدة انفجار رباعي الصبغيات المتلقية عن طريق الاندماج والثقافة المختبرية. بعد ذلك ، يتم حقن IPSC في مساعدة الانفجار رباعي الصبغيات ويتم زرع مساعدة الانفجار المكملة للإناث المتلقية للحمل.

في الخطوة الأخيرة ، يتم تسليم الكاملة عن طريق الولادة القيصرية وللأمهات البديلات. لذلك يمكن مراقبة تطور ما بعد الولادة. في النهاية ، إذا تم إنشاء كاملة المدة قابلة للحياة.

خط الفحص IPSC متعدد القدرات بالكامل. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى لتوليد I PSCs هي أن طريقتنا تولد بشكل متكرر خطوط خلايا IPS متعددة القدرات بالكامل قد تكون خطوط خلايا IPS التي تم إنشاؤها بواسطة هذه الطرق مفيدة للمحققين الآخرين الراغبين في مقارنة تعدد القدرات لخلايا IPS الخاصة بهم أو لتحديد تكافؤ طرق إعادة البرمجة الأخرى. ستكون هذه الأساليب مفيدة للباحثين الراغبين في إنشاء خطوط خلايا IPS متعددة القدرات بالكامل لتطبيقات نهائية محددة مثل فحوصات التمايز في المختبر.

علاوة على ذلك ، توليد جميع فئران IPSC. قد يكون استخدام تكميل telo بمثابة وسيلة مفيدة لتحديد الاستقرار الجيني واللاجيني لخطوط الخلايا المختلفة. تعتبر التلاعبات الدقيقة التي ينطوي عليها تكميل الجنين رباعي الصبغيات تحديا تقنيا.

قد يستغرق الأمر عدة أشهر حتى يصبح شخص ما بارعا في التقنيات التي تم تطويرها بواسطة هذه التقنية تتطلب ظروف ثقافة مماثلة لتلك المستخدمة في تجارب استهداف الجينات ESL التقليدية. بعد 24 ساعة من تعداء خلايا HEC 2 9 3 T مع فيروس العدس. قم بإزالة وسط النمو واستبدله ب 25 مل من تقنية التسخين الجديد.

متوسط العودة عرافة المنقولة إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة ، بعد 48 ساعة من تعداء خلايا HEC 2 9 3 T مع فيروس العدسي تجمع وسط النمو الذي يحتوي على جزيئات الفيروس من الخلايا المنقولة. إزالة بقايا الجسيمات من الوسائط المحتوية على الفيروس عن طريق الطرد المركزي عند 3000 جي ثانية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بتركيز الفيروس عن طريق الطرد المركزي الفائق من خلال وسادة سكروز بنسبة 20٪ لمدة ساعتين عند 112،000 جي عند أربع درجات مئوية.

صب بعناية في حاوية نفايات لإزالة التلوث دون إزعاج الحبيبات الفيروسية. أعد تعليق الحبيبات الفيروسية في 0.4 مل من وسط الخلايا الليفية الجنينية للفأر وأغلق الأنبوب. ثم هزها برفق عند أربع درجات مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة.

قم بتخزين جزيئات فيروسية وحصص للاستخدام الفردي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. الخطوط مشتقة من الخلايا الليفية الجنينية للفأر ، أو خلايا الميثامفيتامين بمجرد أن تمتلك مستعمرات IPSC حدا انكساريا ساطعا ومحددا جيدا وتحتوي على 30 إلى 50 خلية ، فإنها تكون جاهزة للانتقاء يدويا وتوسيعها كخطوط IPSC مستقلة.

اختر مستعمرات مفردة بطرف ماصة تحميل هلام وانقل كل مستعمرة مباشرة إلى بئر واحد من صفيحة بئر 96 قاع U تحتوي على 20 ميكرولترا من 0.25٪ التربسين EDTA تحتضن المستعمرات المختارة والتربسين لمدة ثماني دقائق عند 37 درجة مئوية أو حتى تنفصل المستعمرات إلى خلايا مفردة. مراقبة تقدم التفكك عن طريق الفحص المجهري الضوئي. قد يكون من الضروري إجراء الترتيبات اللطيفة.

انقل معلق الخلية المنفصل إلى صفيحة بئر 96 تحتوي على طبقة مغذية و 150 ميكرولترا من وسط ESC مكملا بالدوكسيسيكلين و VPA عندما تظهر مستعمرات IPSC مرة أخرى في كل بئر مقسمة إلى آبار أكبر للتحليل وتخزين الخلايا باستخدام اشتقاق ESC القياسي وإجراءات زراعة الخلايا لبدء إجراء توليد مساعدة الانفجار رباعي الصبغيات. يتم زراعة أجنة خلية واحدة تم جمعها من إناث الفئران إلى جنينين خليين بين عشية وضحاها في KSOM عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون في اليوم التالي. ضع شريحة BTX الصغيرة في طبق بتري بطول 10 سم.

صب ما يكفي من وسائط الانصهار الكهربائي بدرجة حرارة الغرفة لغمر الشريحة في المحلول ، ولكن ليس لدرجة أن أقطاب القطب مغمورة تماما. قم بتشغيل مناور الخلايا الكهربائية BTX ECM 2001 ومحسن BTX 400. قم بتوصيل كبلات ECMs بقطب الشرائح الصغيرة وقم بتثبيت الكابلات على جانب طبق بتري لمنع الحركة غير المقصودة للشريحة.

قم بتشغيل نبضة يدوية واحدة للحصول على قراءة على محسن BTX ولاحظ جهد تيارات التيار المستمر التي يتم تطبيقها. سيتحكم تيار التيار المتردد في السرعة التي تتماشى بها الأجنة بين الأقطاب الكهربائية. سيقوم تيار التيار المستمر بدمج التجديف وسيقوم وقت النبض بتعيين طول نبضة التيار المستمر.

نقطة البداية الجيدة هي التيار المتردد ثلاثة فولت تيار مستمر 100 فولت ومرات 0.05 مللي ثانية. يختلف التيار المستمر الأمثل في حدود 90 إلى 150 فولت. باستخدام ماصة الفم.

خذ 30 إلى 42 جنينا خليا من مزرعة KSOM وانقلها إلى قطرة من الاندماج الكهربائي. غسل متوسط من خلال عدة قطرات من وسط الانصهار الكهربائي. بعد ذلك ، اسحب وسيط الانصهار الكهربائي الجديد من طبق الانزلاق الصغير إلى ماصة الفم.

خذ الأجنة المغسولة وضعها في فجوة ملليمتر واحد بين الأقطاب الكهربائية على الشريحة الصغيرة. كن حذرا من محاذاة الأجنة أسفل منتصف الفجوة وعدم الاتصال ببعضها البعض. قم بتطبيق تيار التيار المتردد بالضغط على زر البدء اليدوي.

سوف تدور الأجنة في مجال التيار المتردد حتى يكون مستوى التلامس الصارخ موازيا للأقطاب الكهربائية. إذا لم تتم محاذاة الأجنة في بضع ثوان ، فقم بزيادة إعداد التيار المتردد. بعد محاذاة الأجنة ، اضغط على زر البدء اليدوي مرة أخرى لتطبيق نبضة التيار المستمر مع وسط الانصهار الكهربائي في الماصة.

اجمع الأجنة من الشريحة الدقيقة ، اغسل الأجنة من خلال عدة قطرات من وسط KSOM ثم زرع الأجنة في KSOM تحت الزيت المعدني عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. يجب أن يكتمل اندماج الناسف في أقل من 30 دقيقة. في المزرعة ، راقب واختر الأجنة ذات الأريمات المنصهرة بنجاح.

ستظهر الأجنة المنصهرة في مرحلة الخلية الواحدة التي يتم التخلص منها وجنينتين الخليتين بعد 30 دقيقة في المزرعة ، واستمر في زراعة الأجنة المنصهرة في قطرات صغيرة من KSOM تحت الزيت المعدني عند 37 درجة مئوية. 5٪ ثاني أكسيد الكربون لتحضير IPCs لإذابة حقن الانفجار ، وقم بوضعها على مغذيات في ممر متوسط ESC إلى الخلايا مرة واحدة على الأقل على المغذيات. بعد الذوبان قبل الاستخدام للحقن.

سيوفر بئر واحد من ستة آبار تحتوي على 70 إلى 80٪ من IPCs المتجمعة أكثر من عدد كاف من الخلايا لوسط نمو الحقن والنفطة ويغسل الخلايا بثلاثة ملليلتر من PBS بدون كالسيوم أو مغنيسيوم عند 0.5 مل من التسخين المسبق ، 0.05٪ تريبسين في EDTA للخلايا وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق مع هزاز عرضي عند 3.0 مل من وسط ESC والتكرار للحصول على واحد تعليق الخلية. راقب الخلايا عن طريق الفحص المجهري الضوئي للتأكد من أن معلق خلية واحدة أو مستعمرات أو مجاميع خلايا سوف تسد ماصة الحقن. بمجرد تحقيق تعليق خلية واحدة ، أضف ملليلتر واحد من وسط ESC إلى البئر وأعد اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية.

احتضن لمدة 15 دقيقة أو حتى تبدأ غالبية الخلايا المغذية في الالتصاق ، قم بإزالة الوسيط الذي يحتوي على IPCs برفق. الحرص على عدم إزاحة الخلايا المغذية الأسبوعية الملتصقة. ضع IPCs في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على خمسة ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي المتوسطة ESC عند 200 Gs لمدة خمس دقائق.

قم بشفط المادة الطافية وإزالة ما تبقى من وسيط ESC باستخدام ماصة دقيقة. اضغط على الأنبوب لإخراج الحبيبات وأعد تعليق الخلايا برفق في 0.2 إلى 0.5 مل من وسط FHM المبرد مسبقا. قم بتخزين الخلايا على الجليد حتى وأثناء الحقن في مساعدات الانفجار رباعي الصبغيات للحصول على بروتوكول حقن مساعدة الانفجار ، يرجى الرجوع إلى المخطوطة المصاحبة لهذه المقالة وإلى مقال جاهد منشور مسبقا ، يتم عرض مقتطف منه على الشاشة هنا.

تظهر في هذه الصور أمثلة على التقدم المورفولوجي من الخلايا الليفية إلى مستعمرات IPSC أثناء تجربة إعادة البرمجة. يجب ملاحظة عدم التجانس المورفولوجي وتكوين مستعمرة IPSC المعاد برمجتها جزئيا بدءا من أربعة إلى خمسة أيام بعد إصدار الدوكسيسيكلين VPA كما هو موضح في اللوحات B إلى EESC. مثل مستعمرات IPSC يجب أن تظهر ما بين سبعة إلى 10 أيام كما هو موضح في اللوحة F.إن إنتاج أجنة telo خلية واحدة عن طريق الاندماج الكهربائي لأجنة ثنائي الصبغيات ثنائي الصبغيات ثنائي الصبغيات عالي الكفاءة.

من المعتاد ملاحظة ما يصل إلى 95٪ من أجنة الخلية المعالجة التي تم دمجها بنجاح لإنتاج أجنة خلية واحدة رباعي الصبغيات. يشبه البروتوكول المستخدم في هذه التجربة لحقن IPSC في مساعدة الانفجار رباعي الصبغيات بروتوكول حقن E SES في مساعدة الانفجار ثنائي الصبغيات لتوليد الفئران الوهمية لاستبعاد توليد الوهم ثنائي الصبغيات بسهولة ، ويتم اختيار تصبغ سلالات الفئران المستخدمة لتوليد IPSes والأجنة رباعية الصبغيات بعناية عندما يكون ذلك ممكنا. في هذا المثال ، يتم إنتاج الأجنة رباعية الصبغيات من سلالة ألبينو ويتم إنشاء IPSC من سلالة مصطبغة.

وهكذا تظهر الفئران حديثي الولادة IPSC عيونا مصطبغة ولون معطف مصطبغ بشكل موحد في مرحلة البلوغ ، في حين أن kyras ثنائية الصبغيات ستعرض ألبينو مختلط وتلوين مصطبغ. يعتمد عدد الجراء الأحياء المولودين على خط الخلية كما هو موضح في هذا الجدول. بالنسبة لخط IPSC الجيد المتوسط ، يجب أن يتوقع المجربون ما بين 1٪ و 10٪ من مساعدة الانفجار المحقونة لإنتاج صغار حديثي الولادة حية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اشتقاق خلايا IPS متعددة القدرات بالكامل وأيضا كيفية التحقق من صحة إمكاناتها التنموية. باستخدام مقايسة تكميل رباعي الصبغيات بمجرد إتقان هذه التقنية من اشتقاق MES إلى IPSC حديثي الولادة ، يمكن إكمال الفئران من شهرين إلى ثلاثة أشهر. يتطلب تطوير وصيانة الخلايا القصيرة المستوى مستوى عال من تقنية زراعة الخلايا.

الخبرة السابقة مع ثقافة اللغة الإنجليزية كلغة ثانية ضرورية. لا تنس العمل مع فيروس العدسات ، وخاصة فيروس العدسات المركز يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب على المرء دائما ارتداء معدات الحماية الشخصية التي تتطلبها مؤسستك والتأكد من علاج كل ما يتلامس مع الفيروس ، مع 10٪ مبيض لمدة 20 دقيقة على الأقل بعد هذا الإجراء.

يمكن تحليل جميع فئران IPSC وأنسجتها بحثا عن الأنماط الظاهرية الفسيولوجية والمرضية والسلوكية.