عملية الوحش الأخضر لتوليد سلالات الخميرة حمل حذوفات متعددة الجينات

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج سلالات من الخميرة تحمل عمليات حذف متعددة مميزة بجين تقريري للبروتين الفلوريسنتي الأخضر. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير طفرات مفردة أحادية الصيغة الصبغية تسمى "pro monsters"، حيث تحمل كل منها كاسيت حذف GFP بدلاً من أحد الجينات المستهدفة. وتتمثل الخطوة الثانية في فرز عمليات الحذف عبر التزاوج والتقسيم لسلالات الخميرة باستخدام مجموعتين من علامات الاختيار ثنائية الصيغة الصبغية وأحادية الصيغة الصبغية تسمى GM toolkit A و GM toolkit alpha، والتي تتواجد أيضاً في سلالات pro monster.

بعد ذلك، يتم اختيار الخلايا ذات الفلورة العالية من الجمهرة الميوتية باستخدام قياس التدفق الخلوي لإغناء السلالات التي تحمل حذفين. والخطوة النهائية هي تأكيد الأنماط الجينية للسلالات التي تم فرزها. وفي نهاية المطاف، تؤدي جولات متكررة من التزاوج والإغناء بقياس التدفق الخلوي، بدءاً من السلالات الناتجة، إلى توليد سلالات ذات حذفات متعددة وبعدد أكبر.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل طريقة G لإعادة استخدام العلامات والحذف الجيني المتسلسل، في إمكانية الحصول على عمليات حذف متعددة في كل دورة، مما يؤدي إلى تجميع أسرع للطفرات المتعددة. بعد إنتاج سلالات pro monster كما هو موضح في البروتوكول المكتوب المرافق لهذا الفيديو، تبدأ دورات التزاوج عن طريق تحضير مستنبتات من سلالات حذف GFP pro monster المستقرة في أنبوب إبندورف سعة 1.6 milliliter. قم بتحضير سلالة الحذف من نمط التزاوج A في 100 microliters من الوسط الاصطناعي الكامل الخالي من الهيستامين، والذي يُشار إليه باسم وسط minus his. كما يتم تحضير سلالة الحذف من نمط التزاوج alpha في 100 microliters من الوسط الاصطناعي الكامل الخالي من الليوسين، أو وسط minus lu، في أنبوب إبندورف سعة 1.6 milliliter لضمان التبادل الهوائي.

اصنع ثقوباً في أغطية الأنابيب باستخدام دبوس دفع مُعالج بـ 70% ethanol. قم بتدوير الأنابيب أفقياً عند 30 درجة Celsius طوال الليل. يجب أن يكون محور الدوران موازياً للمحور الطولي للأنبوب.

بناءً على تقدير الكثافة الضوئية، اخلط حوالي 250,000 خلية haplo و 250,000 خلية alpha haplo من سلالات GFP deletion في أنبوب einor سعة 1.6 milliliter. وعادةً ما يقابل هذا العدد من الخلايا 7 µL من كل مستنبت overnight culture مع الرج بجهاز vortex. لتحضير هذه الخلايا، ابدأ بتركيزها عن طريق الطرد المركزي عند 800 G لمدة دقيقتين.

بعد إزالة السدادة، اصنع ثقباً في الغطاء باستخدام دبوس دفع مُعالج بـ 70% ethanol. وللسماح بتبادل الهواء، أضف 50 µL من وسط YPDA بعد إجراء عملية طرد مركزي سريعة بالدوامة لعينتك عند 800 G لمدة خمس دقائق. ثم ضع الأنبوب في صندوق رطب مُعد من صندوق رؤوس ماصات فارغ، وحامل رؤوس صغير، ومنشفة ورقية مبللة.

يتم تحضين الصندوق طوال الليل عند 30 درجة مئوية. يتم نقل 10 µL من خليط التزاوج إلى 500 µL من وسط GNA الخالي من الآجار والمحتوي على المضادات الحيوية G 4 1 8 و nat في أنبوب زراعة سعة 5 mL بغطاء مرتخٍ، على أن تكون الكثافة الضوئية الأولية عند 600 nm حوالي 0.1. يتم تدوير المزرعة عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

يسمح هذا باختيار الخلايا ثنائية الصيغة الصبغية لأن الخلايا ثنائية الصيغة الصبغية التي تحتوي على كل من MX4 في GM toolkit A وnat MX4 فقط هي التي يمكنها النمو في وجود G418 وNat. انقل 20 µL من المزرعة ذات اليوم الواحد إلى 500 µL من وسط GN الطازج الذي يحتوي على G418 وnet. تكون الكثافة الضوئية الابتدائية عند 600 nm تقريبًا 0.2.

قم بتدوير الأنبوب عند درجة حرارة 30 degrees Celsius لمدة خمس ساعات للوصول بالخلايا إلى طور النمو اللوغاريتمي. ثم قم بمزامنة ثنائيات الصيغة الصبغية وعزل الأبواغ. اتبع الإجراء الموضح في البروتوكول المكتوب.

قم بتقسيم معلق الخلايا المرتبطة بـ SPO إلى جزئين، سعة كل منهما 300 µL، وضع كل جزء في أنبوب Eppendorf منفصل سعة 1.5 mL. قم بإجراء عملية الطرد المركزي للأنابيب عند 800 G لمدة خمس دقائق. بعد إزالة السائل الطافي، اصنع ثقباً في غطاء كل أنبوب.

باستخدام دبوس دفع، أضف 100 µL من الوسط الخالي من histidine إلى الراسب في أحد الأنابيب. ولاختيار السلالات ذات النمط الجيني haploids من نوع PT في الأنبوب الآخر، أضف 100 µL من الوسط الخالي من leucine لاختيار السلالات من نوع alpha haploids.

قم بتدوير الأنابيب عند درجة حرارة 30 درجة Celsius طوال الليل. يجب أن تكون الكثافة الضوئية النهائية عند 600 nanometers أقل من 0.5. إذا كانت الكثافة الضوئية عند 600 nanometers تميل إلى أن تكون مرتفعة للغاية، قم بتدويرها في درجة حرارة الغرفة.

لتحفيز GFP، أضف 100 µL من وسط minus hiss أو minus LU الطازج الذي يحتوي على 20 µg/mL من doxycycline إلى السلالات المختلفة. يكون التركيز النهائي لـ doxycycline هو 10 µg/mL. قم برج الأنبوب باستخدام جهاز Vortex ثم قم بتحضينه في جهاز هزاز عند 30 °C لمدة يومين.

لبدء عملية قياس التدفق الخلوي، أضف 900 µL من محلول TE المنظم المفلتر مسبقاً إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 5 mL، مع استبدال الغطاء بغطاء مصفاة خلايا من أنبوب بوليسترين سعة 5 mL. تعد أنابيب البولي بروبيلين مناسبة لقياس التدفق الخلوي، ويُستخدم غطاء المصفاة لإزالة الجسيمات الكبيرة.

ضع برفق 75 µL من المحلول المنظم على غطاء مصفاة الخلايا. أضف 25 µL من الخلايا المستحثة إلى المحلول الموجود على الغطاء مع ضغط طرف الماصة مقابل الشبكة. ادفع كل المحلول الممزوج عبر المصفاة.

اضغط على غطاء المصفاة ثم قم برج الأنبوب باستخدام جهاز المزج الدوامي (vortex). جهز أنابيب الجمع، وهي أنابيب fendor سعة 1.6 milliliter مملوءة بـ 200 microliters من وسط minus hiss أو وسط minus lube. قم بتشغيل جهاز فرز الخلايا واضبط الإعدادات وفقاً لدليل الشركة المصنعة.

قم برج أنابيب الجمع باستخدام جهاز المرج (vortex) لتغطية جدرانها بالوسط. وكذلك قم برج الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا باستخدام جهاز المرج قبل تحميلها في جهاز فرز الخلايا. ثم قم بالحصول على بيانات قياس التدفق الخلوي للعينة.

يمكن استخدام سلالة تفتقر إلى GFP كضابط سلبي. ارسم بوابات للفرز لتجنب تجمعات الخلايا، والتي قد تُظهر شدة GFP عالية. استبعد القيم الشاذة ذات عرض النبضة أو المساحة الكبيرة بشكل غير متناسب لتشتت الضوء الأمامي المختصر باسم FSC باستخدام مخطط عرض النبضة وارتفاع النبضة، أو مخطط مساحة FSC وارتفاع FSC.

بما أنه يُتوقع الحصول على قيم FSC عالية للتجمعات الخلوية، يتم اختيار الخلايا الموجودة في أدنى 20% من FSC فقط. تجنب المناطق ذات القيم الأدنى لـ FSC والتشتت الجانبي أو SSC حيث توجد عادةً الحطام الخلوي. وغالباً ما يكون هناك ارتباط إيجابي بين إشارة SSC وإشارة GFP.

لتجنب إثراء الخلايا ذات قيمة SSC أعلى، ارسم بوابة على طول محيط المجموعة باستخدام مخطط لكثافة GFP وSSC لأخذ نسبة مئوية مماثلة من الخلايا الأكثر سطوعاً من كل نقطة على طول محور SSC مجتمعة. يجب تحديد 0.1 إلى 1% من المجموعة الفرعية التي تم اختيارها باستخدام بوابات FSC وSSC قبل هذه الخطوة لفرز 200 خلية في أنبوب التجميع. قم برج أنبوب التجميع باستخدام جهاز vortext لتغطية الخلايا المفروزة بالوسط الغذائي.

مجموعة فرعية من الخلايا على طبق A-Y-P-D-A من أجل التنميط الجيني. يتم تحضين الطبق عند 30 درجة Celsius لمدة يومين بعد عملية التحضين. يتم تحضير محلول تحليل لـ 12 مستعمرة تقريبًا.

اتبع الخطوات الموضحة في البروتوكول المكتوب لإجراء التنميط الجيني. قم بتحليل 1 µL من المستخلص المخفف باستخدام تفاعل PCR بحجم 10 µL مع بادئ أمامي. يرتبط هذا البادئ بالمنطقة المجاورة العلوية لكل جين محذوف، مقترناً ببادئ مشترك يرتبط داخل جميع مواقع الحذف.

يمكن إجراء تفاعل PCR في تنسيق 96 أو 384 بئراً. وبمجرد انتهاء التضخيم، يتم تحليل نواتج PCR باستخدام الفصل الكهربائي.

حدد السلالات أحادية المجموعة الصبغية (haplos) التي يُحتمل أن تمتلك الأنماط الجينية المطلوبة. قم بتنمية هذه السلالات على طبق جديد. كما يجب تجميدها في 25% glycerol عند -80 °C.

يُنصح بإجراء اختبارات إضافية مثل التأكد من غياب تسلسلات النوع البري للجينات المحذوفة وإجراء الفصل الكهربائي للهلام الميداني (field gel electrophoresis) اللاحق. كرر عملية الدورة الجنسية باستخدام سلالات مفيدة. تم تحفيز النسل أحادي الصيغة الصبغية (Haplo progeny) الناتج عن تهجين سلالتين للتعبير عن البروتين الفلوري الأخضر GFP.

تضمن كل حذف جيني كاسيت GFP؛ حيث تم اختيار مجموعة من الخلايا الناتجة باستخدام البوابات بواسطة مقياس التدفق الخلوي. ومن غير المرجح أن تحتوي هذه المجموعة على حطام أو تجمعات خلوية. تم فرز والاحتفاظ بأكثر الخلايا سطوعاً بنسبة 1% عن طريق تحديد بوابات الخلايا بناءً على مساحة التشتت الأمامي وارتفاع التشتت الأمامي.

تم استبعاد التجمعات الخلوية، والتي تميل إلى امتلاك مساحة تشتت أمامي كبيرة بشكل غير متناسب، أو تم استبعادها عن طريق تحديد الخلايا بناءً على التشتت الأمامي والتشتت الجانبي؛ حيث قُبلت الخلايا الموجودة في أدنى 20% من التشتت الأمامي مع استبعاد الحطام الخلوي ذي أدنى تشتت أمامي وجانبي من خلال تحديد الخلايا بناءً على التشتت الجانبي وإشارة GFP، وتم اختيار الخلايا الأكثر فلورية من بين تلك الموجودة في نطاق تشتت جانبي معين للسماح بمقارنة المزيج الميوزي مع عينة الضابط السلبية التي لا تعبر عن GFP. ويظهر في المخطط GA مطابق لذلك المستخدم لاختيار مجتمع P three. وبالنسبة للخلايا المختارة بشكل مشابه من الضابط السلبي في haplos منفصل، فقد تم تحليلها بواسطة PCR بعد تحفيزها للتعبير عن GFP وفرزها بناءً على الفلورية. وكان عدد الحذوفات المتوقع لخلية غير مفرزة ناتجة عن الانعزال العشوائي هو 7.5.

في هذه التجربة المحددة، بلغ متوسط عدد عمليات الحذف في الخلايا المفروزة 8.8 ± 0.3، بما في ذلك خمس خلايا تحتوي على 10 عمليات حذف. النمط الجيني DO. تم إجراء فرز سلالات PCL باستخدام بادئ عكسي.

يرتبط بادئ That 10 بالمنطقة المجاورة للمصب المقترنة ببادئ أمامي. ويرتبط بادئ That 10 بنهاية الكاسيت. ويشير ظهور حزمة إلى وجود كاسيت GFP.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام "طريقة الوحش الأخضر" (green Monster Method) لهندسة عمليات الحذف في الخميرة.