وظيفية تقييم الحركة المعوية والتهاب الأمعاء الجدار في القوارض: التحليلات في نموذج موحد من التلاعب المعوية

الهدف العام من التجارب التالية هو إجراء تلاعب معوي لدراسة تطور وانحلال العلوص التالي للجراحة في نموذج من القوارض، ويتم تحقيق ذلك من خلال تلاعب معياري بالأمعاء الدقيقة بين مسحتين قطنيتين رطبتين. بعد ذلك، يتم تحليل عبور الجهاز الهضمي والقولون لقياس الحركية بعد الجراحة. ثم يتم إجراء تحليل كيميائي نسيجي وزراعة عضوية للعضلة الخارجية للأمعاء الدقيقة لفحص مستويات الالتهاب.

تم الحصول على نتائج تظهر ارتشاحاً قوياً للخلايا المحببة المتعادلة إلى الغشاء المخاطي وإنتاجاً زائداً لأكسيد النيتريك في مستنبتات الغشاء المخاطي، مما أدى إلى تأخر أوقات العبور في الجهاز الهضمي والقولون. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بتطور وعلاج العلوص بعد الجراحة، وفي استقصاء سبل الوقاية أو العلاج المحتملة. سيقوم ماريو لويسون، وهو فني من مختبرنا، بشرح الإجراء. بعد إعطاء 0.8 إلى 1% من isoflurane في الأكسجين لفأر ذكر، ضع الحيوان في وضعية الاستلقاء على الظهر واستخدم شريطاً لاصقاً لتثبيت الأطراف.

استخدم محفز ألم طفيف لاختبار التخدير العميق. ثم قم بإجراء شق جراحي في منتصف البطن بطول سنتيمترين. بعد ذلك، أدخل مباعدين معقمين لإبقاء البطن مفتوحاً، وقم بإخراج الأمعاء الدقيقة بعناية نحو اليسار وضعها على شاش قطني مبلل.

باستخدام مسحتي قطن رطبتين، يتم تفريغ محتويات التجويف للـ small bowel بأكملها عن طريق دحرجة المسحتين في وقت واحد من الـ pori وصولاً إلى الـ cecum. يُعاد الأمعاء إلى التجويف البريتوني دون التوائها لمنع حدوث ischemia أو انسداد ميكانيكي، وذلك باستخدام طبقتين من غرز polyamide غير قابلة للامتصاص مقاس 5.0 بشكل مستمر. ثم يتم إغلاق الشق البطني.

ضع الحيوان تحت مصباح تدفئة وراقبه حتى يفيق من التخدير. بعد ذلك، أعد الفأر إلى قفصه واسمح له بالوصول إلى الطعام والماء. في اليوم التالي.

بعد تخدير الفأر تخديرًا كاملاً، قم بمد رأسه للخلف بعناية واستخدم ملاقط غير حادة لسحب اللسان، ثم املأ محقنة سعة 1 مل بما لا يقل عن 100 µL من الديكستران المسمى بالفلوريسين. قم بتوصيلها بقسطرة شريانية وأدخل القسطرة بعناية كأنبوب معدي في المعدة. احقن 100 µL من FITC dextran بسرعة ثم قم بإزالة القسطرة.

اترك الحيوان حتى يستعيد وعيه وانتظر لمدة 90 دقيقة. بعد مرور الـ 90 دقيقة، قم بقتل الفأر رحيمًا واستأصل القناة الهضمية بالكامل من المعدة وصولاً إلى المستقيم. ضع الأمعاء على وسادة من البوليسترين مع تجنب تمديدها.

بعد ذلك، قم بقياس الطول الكامل للأمعاء الدقيقة والقولون. استخدم القنيات لتثبيت الأمعاء على وسادة البوليسترين. قم بتقسيم الأمعاء الدقيقة إلى 10 أجزاء متساوية والقولون إلى ثلاثة أجزاء متساوية.

بعد قطع الأمعاء عند المواضع المحددة، اغسل المقاطع مرة واحدة باستخدام 1 mL من محلول كرِبز-هيلي، بفر البيكربونات، أو KHB. انقل المقاطع إلى أنابيب سعة 2 mL مرقمة بالتتابع، ثم قم برجها بقوة باستخدام جهاز الفورتكس ثم طردها مركزياً. بعد ذلك، انقل السائل الطافي إلى أنابيب نظيفة مرقمة سعة 1.5 mL.

تُحفظ في درجة حرارة 4 °C في الظلام حتى يتم التحليل. بعد ذلك، وباستخدام الماصة، يتم نقل حصص مكررة بحجم 100 µL من كل سائل طافٍ إلى لوحة سوداء ذات 96 بئراً، ثم تُستخدم قارئة الفلورية لقراءة اللوحة للتحقق من وقت العبور القولوني بعد تخدير الحيوان أسبوعياً.

افحص نفاذية القولون بعناية عن طريق إدخال ناسور. استخدم المسبار للسبر من خلال الشرج وصولاً إلى القولون. أدخل كرة زجاجية بقطر 2 mm على عمق 3 cm داخل القولون، ثم أخرج المسبار.

ابدأ تشغيل المؤقت فوراً. ضع الفأر في قفص شفاف وراقبه طوال الفترة الزمنية التي يستغرقها إخراج الكرة. وذلك من أجل التحليل الكيميائي النسيجي لعينات الأمعاء الغليظة.

بعد قطع أجزاء من أنسجة الأمعاء وغمرها في محلول KHB البارد في طبق مملوء بالسيليكون، استخدم إبر الحشرات لتثبيت المساريق في الطبق. قم بفتح الأجزاء المقطوعة على طول الحافة المساريقية وشد النسيج إلى 120% من طوله وعرضه. ثبّت النسيج باستخدام الإبر بدءاً من المساريق ميكانيكياً.

افصل الطبقة العضلية الخارجية (muscularis externa) عن الطبقة المخاطية (tunica mucosa). قم بتثبيت العينات وصبغها وفقًا للجزء المكتوب من هذا البروتوكول الخاص بالزراعة. الطبقة العضلية الخارجية.

بعد 24 ساعة من إجراء المعالجة المعوية، يتم استئصال الأمعاء الدقيقة بأكملها ووضعها في محلزول KHB بارد يحتوي على البنسلين G والستربتومايسين. تُقطع الأمعاء إلى قطع بطول ثلاثة سنتيمترات، ويُثبت كل جزء على طبق زجاجي مغطى بالسيليكون باستخدام مقص دقيق. ثم يُزال المساريق وتُنزلق الأمعاء فوق إبرة ذات رأس منحني باستخدام ملاقط حادة.

قم بتشريح الغشاء المخاطي بلطف باستخدام مسحة قطنية مبللة. انزعه من تحت المخاطية وضعه في محلول KHB بارد مضاف إليه PS. بعد ذلك، قطع شرائط الغشاء المخاطي إلى قطع يتراوح طولها بين 2 إلى 4 مليمتر، وحضنها في محلول KHB بارد جداً مضاف إليه PS لمدة 30 دقيقة، مع شطف العينة عدة مرات.

ثم انقُل حوالي 50 إلى 60 milligrams إلى طبق زراعة معقم بـ 24 بئراً يحتوي على 500 µL من DMEM. يتم تحضين النسيج عند 37 °C و 5% CO2 لمدة 24 ساعة. اجمع الطافي وقم بطرده مركزياً عند 1000 RCF لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، قم بالتجميد السريع باستخدام النيتروجين السائل لقياس السيتوكينات أو أكسيد النيتريك. وأخيراً، استخدم منديلاً ورقياً نظيفاً لتجفيف نسيج العضلات لمدة 30 ثانية ثم قم بوزنه. إن أهم معيار لتقييم شدة العلوص التالي للجراحة هو فحص عبور الجهاز الهضمي أو GIT في الجسم الحي.

يوضح هذا الشكل توزيعاً نموذجياً لـ FITC dextran على طول القناة الهضمية في مجموعات الضبط غير المعالجة والفئران التي خضعت لتلاعب معوي بعد 24 ساعة من الجراحة. وكما هو موضح هنا، أظهرت الحيوانات التي خضعت لجراحة وهمية قناة هضمية طبيعية مع مركز هندسي محسوب في الأعور. بينما أدى Im إلى تأخير ملحوظ في القناة الهضمية في الصائم القريب، وفي تحليل حركية القولون باستخدام كرة زجاجية، قامت الفئران التي خضعت لجراحة وهمية بإخراج الكرة خلال 48 إلى 200 ثانية، بينما أدى Im إلى إطالة وقت الإخراج ليصل إلى 470 إلى 775 ثانية لقياس الالتهاب.

فيما يلي، تم تحليل مستويات الكريات البيضاء داخل الغشاء المخاطي المعوي باستخدام الكيمياء النسيجية أو الكيمياء النسيجية المناعية كما هو موضح هنا. لوحظ وجود القليل من الخلايا المتعادلة متعددة النوى في الفئران الضابطة، ومع ذلك، أدى التهاب الأمعاء الدقيقة إلى ارتشاحها القوي. ومن الصعب الكشف عن العديد من الوسائط الالتهابية التي تفرزها الخلايا في الأنسجة.

تسمح مستخلصات المزارع العضوية بالكشف عن العلامات الالتهابية في المزرعة. في السائل الطافي، يُعد أكسيد النيتريك، أو no، وسيطاً ممثلاً في POI، وهو ناقل عصبي تثبيطي رئيسي في الجهاز الهضمي. يوضح هذا الشكل أنه لم يتم الكشف عن nno في me.

في المزارع العضوية، والمنقوعات فائقة الترشيح لمجموعات الضبط، والحيوانات التي خضعت لعملية وهمية، لوحظت مستويات قاعدية من nno. ومع ذلك، فإن مزارع الفئران التي خضعت لمعالجة معوية تنتج كميات أكبر بكثير من nno بعد تحضين لمدة 24 ساعة بمجرد إتقان العملية. يمكن تنفيذ تقنية المعالجة المعوية هذه في غضون 15 دقيقة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز العطالة المعوية بعد الجراحة في الفئران وكيفية تحليل شدتها.