Name: عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: اكتشف طريقة تنقية عالية الإنتاجية للبروتينات المؤتلفة الموسومة بـ His في E. coli باستخدام منصة آلية. تضمن هذه التقنية قابلية التكرار وتقلل من الأخطاء البشرية في التجارب البيوكيميائية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل على منحة المشروع ويلكوم (078043/Z/05/Z) لROJW

PART A: عالي الإنتاجية نمو الثقافات البكتيرية. 1. تنمو البكتيريا بين عشية وضحاها في 2 مل من متوسطة Autoinduction باستخدام 24 لوحات جيدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sterilise لوحات 24 جيد من قبل الميكروويف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم 1.5 مل من المتوسط ​​autoinduction (بين عشية وضحاها اكسبرس متوسطة) مع المستعمرات البكتيرية نمت حديثا أو الجلسرين الأسهم المجمدة. ونحن عادة تطعيم ثلاثة آبار في المستعمرات الفردية متحولة مع 3 المستنسخة. الاحتياطي ستة آبار لعناصر إيجابية وسلبية. لعناصر إيجابية نكبر استنساخ wildtype الثلاثة وللضوابط السلبية نحن في استنساخ بنسبة 2 التي تم تحويلها مع البلازميد غير التعبير عن. تحقق من وجود التعقيم الكافي لوحة من ترك واحدة فارغة تماما لسيطرة المتوسطة فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية وتهتز في 250 دورة في الدقيقة. نستخدم لاك محرض BL21 (DE3) رشيد 2 الخلايا. Autoinduction المتوسطة يحتوي على خليط من الجلوكوز واللاكتوز. البكتيريا في البدايةتتغذى على السكر ومن ثم البدء في استخدام اللاكتوز، والذي يدفع أيضا التعبير عن البروتينات المؤتلف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء ووضع لوحة على منصة الروبوتية. </li></ol> B PART: تنقية البروتينات المؤتلف من الروبوتية. 2. إعداد منهاج الروبوتية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل العازلة يغسل ملي تتكون من إيميدازول 20، 0.1٪ تريتون X-100، 0.5 M كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، خلات، ودرجة الحموضة 7.9، 10 ملي MgOAc 2، 0.7 مم ZnOAc 2، الجلسرين 10٪، وشطف العازلة التي تتكون من الاميدازول M 0.5، 0.1٪ تريتون X-100، 0.5 M كلوريد الصوديوم، و 20 ملي تريس، خلات، ودرجة الحموضة 7.9، 10 ملي MgOAc 2، 0.7 مم ZnOAc 2، الجلسرين 10٪. وسوف تستخدم هذه المخازن المؤقتة لغسل حبات بعد أن تم ملزمة البروتينات الموسومة لهم، أو أزل إلى البروتينات من الخرز، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل مخفف البكتيرية (100 مل ماء مقطر مع 15 ميكرولتر كاشف مضاد الرغوة). وسيتم استخدام هذا الحللجعل التخفيفات الثقافات البكتيرية ليلة وضحاها لكثافة بصرية (A600) القياسات. وجود مضاد الرغوة في مخفف يمنع تشكيل فقاعات الهواء التي من شأنها أن تتداخل مع قارئ لوحة القياسات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل الحل يتكون من تحلل كاشف FastBreak 10X، 2 ميكرولتر لكل عينة lysonase و15 مم MgOAc 2. FastBreak يحتوي على مزيج من المنظفات والأملاح التي كسر جدران الخلايا البكتيرية وتسهيل الإفراج عن البروتينات داخل الخلايا. Lysonase هي مزيج من الملكية والليزوزيم نوكلياز أ. الليزوزيم يساعد في تعطيل جدار الخلية ويساعد على هضم نوكلياز صدر الأحماض النووية البكتيرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: مستحضرات لمدة 6 هيدروكلوريد الجوانيدين M الحل. بعض البروتينات المؤتلف تميل إلى التمسك الإبر تفلون المغلفة pipetting. الحل هيدروكلوريد الجوانيدين يبدل طبيعة البروتينات ويغسل لهم قبالة على نحو أكثر فعالية من الماء الذي يستخدم بشكل روتيني لشطف قابل للغسل الروبوتية نصائح pipetting بعد كل شارعالجيش الشعبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الكميات BCA البروتين (حمض bicinchoninic) كاشف عن طريق خلط محلول حمض bicinchoninic (كاشف A) والحل كبريتات النحاس (كاشف B): السندات الببتيد النحاس 2 + تقليل من العنصر 4 كبريتات النحاس الموجودة في الكاشف BCA إلى النحاس حيث 1 + كمية النحاس 1 + يتناسب مع عدد من السندات الببتيد موجودة في الحل. في الخطوة الثانية، اثنين من جزيئات حمض bicinchoninic كلاب النحاس 1 + مما أدى إلى تحول الامتصاصية نانومتر إلى 562، مما أدى إلى اللون الأرجواني. رد الفعل هو اللون المعتمدة على الزمن ويحتاج عادة إلى عدة ساعات تكون نهائية. بعد أن لون ثابت لمدة عدة ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء أحواض أو لوحات من الحجم الصحيح ووضعها في مواضعها المخصصة مسبقا على منصة الروبوتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان واحد 24 لوحة جيدا للنفايات هيدروكلوريد الجوانيدين، واثنين من لوحات واضحة بشكل جيد ل96-OD 600 و قياسات الامتصاصية واحدة زرقاء 96-جيدا لوحة اله تنقية البروتينات على مواقعهم على المنصة. مكان واحد 96-deepwell لوحة على الوقوف المغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع MagneHis ني جزيئات البروتينات التي تربط عن طريق تشكيل يخلب به مع صاحب-5-بهم أضعاف في الماء المقطر وملئها في وحدة حبة التحريك. تبديل النمام على الحفاظ على حبات في التعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على منصة الروبوتية ومسح الإبر pipetting لعدة دقائق لإزالة فقاعات الهواء التي قد تعترض مع دقة pipetting. يتم مسح الإبر pipetting إعادة استخدامها في الخطوات بين pipetting الفردية. وبدلا من ذلك، يمكن أن تستخدم نصائح التخلص منها. يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة من آليا. بروتوكول الروبوتية عند الطلب. </li></ol> 3. يتم فحص نمو الخلايا عن طريق قياس OD600 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تخفيف 10 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها في 90 ميكرولتر من محلول مخفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 إلى التأكد من أن البكتيريا قد نمت لكثافة مماثلة(الشكل 1). </li></ol> 4. يتم تقسيم الخلايا حتى حرر البروتينات والسماح لحبة ملزم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتوزيع 100 ميكرولتر من التعليق المغناطيسي ني حبة في كل بئر من لوحة جيدا 24 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل 900 ميكرولتر من كل ثقافة على نطاق صغير في لوحة البكتيرية 24 جيد يحتوي على الخرز. إضافة 100 ميكرولتر من مزيج FastBreak / lysonase 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل 24 لوحة جيدا إلى منصة تهتز لزعزعة السريع (800 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تتعطل جدران الخلايا البكتيرية من خلال مزيج من القوات الميكانيكية والكيميائية والعمل يتم الإفراج عن البروتينات المنتجة recombinantly إلى الحل. مع تقارب به على الفور أنها تربط حبات النيكل ممغطس مخلبية. </li></ol> 5. تغسل حبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل الخلايا التي تحتوي على الخرز لست] معلق المغناطيسي لوحة 96-deepwell التي يتم وضع على حامل مع مagnetic قضبان تلك الشريحة بين الآبار. لوحات 96-جيدا قد حصلت على مربع مخروطية الشكل السفلي والذي يسمح أسهل إزالة طاف. يمكن للآبار عقد كميات تصل إلى 2.1 مل ولكن تمتلئ أحجام أصغر بكثير. هذا يمكننا من أداء قوي يهز الخطوات دون عينة عبر تلوث الرش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل نصائح ماصة بين الفرد الخطوات pipetting مع 6 M الجوانيدين، حمض الهيدروكلوريك. هذه الخطوة هو أمر حاسم لتنقية TFIIB و &quot;مثبت&quot; البروتينات الأخرى لتجنب انتقال التلوث. مع بروتينات أخرى قد تكون كافية لشطف بالماء على نطاق واسع الإبر بين الخطوات pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قضبان المغناطيسي للموقف المغناطيسي جذب الخرز ممغطس، وسحب بها بعيدا عن مراكز الآبار والسماح للالإبر pipetting حرية الوصول إلى طاف. يتم تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف 500 الأولى ميكرولتر من العازلة غسل لوحة 24 جيدا ونقل فيما بعد إلى لوحة 96-جيدا لهnsure نقل كامل من الخرز. تتم إزالة لوحة 24 أيضا من شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يضاف آخر ميكرولتر 500 من العازلة يغسل مباشرة إلى اللوحة 96-حسنا، يتم نقل لوحة إلى شاكر واهتزت بقوة لمدة 1 دقيقة. تم نقل لوحة إلى موقف المغناطيسي وتجاهل العازلة يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتكرر هذه الخطوة مرتين وانتهاء الإجراء عن طريق إزالة أي غسل بقايا من لوحة العازلة. </li></ol> 6. أزل البروتينات في الاحتياطي شطف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة للشطف الخرز، ويتم نقل لوحة إلى شاكر واهتزت بقوة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم نقل لوحة إلى شاكر وشطافة، والتي تحتوي على البروتين المنقى المؤتلف، يتم نقلها إلى لوحة جديدة. </li></ol> 7. قياس تركيزات البروتينات تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم نقل 190 ميكرولتر من مزيج كاشف BCA إلى لوحة 96-جيدا واضحة و10 ميكرولتر من برووأضاف TEIN الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عدة ساعات من الحضانة (5-6 عادة أو بين عشية وضحاها)، وقياس الامتصاصية وذلك لمقارنة المعايير BSA لتحديد تركيزات كل من البروتين النقي التحضيرات (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن الآن لتنقية البروتينات يمكن استخدامها لتطبيقات المصب في تركيزات المناسب (الشكل 3). </li></ol> 8. ممثل النتائج بروتوكول تنقية يقدم مرحلتين مراقبة الجودة، والأمثلة التي تظهر. ونحن قادرون على تحديد وتوثيق المشاكل المحتملة في مرحلة نمو البكتيريا (الشكل 1) في وقت لاحق وعلى تقييم عوائد من البروتينات المطهرون (الشكل 2). نحن تنقية البروتينات عادة واختبارها في ثلاث نسخ. هذا، جنبا الى جنب مع الخطوات مراقبة الجودة اثنين، يعطينا الثقة في أن أي تغيير لاحظنا في المقايسات الفنية لدينا هي نتيجة لphenotyp متحولةه (الشكل 3) وليس بسبب الاختلافات التجريبية أو التنقيات الفاشلة. الحصول على عوائد تتراوح عادة 50 حتي 200 ميكروغرام وأكثر من كافية لفحوصات الفنية المختلفة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> الشكل 1. الرسم البياني القياسات OD من 24 لوحة جيدا مع الثقافات بين عشية وضحاها. قد نمت الحيوانات المستنسخة ثلاثة من المتغيرات 6 متحولة TFIIB وكذلك من TFIIB wildtype. استنساخ اثنين من يحمل البلازميد غير التعبير عن وبئر مع المتوسط ​​إلا أن تكون بمثابة الضوابط السلبية. القياسات OD تبين أن هناك اختلافات صغيرة في معدلات النمو بين الثقافات الفردية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> الشكل 2. غلة البروتين الحصول عليها من هذه الثقافات على النحو الذي يحدده الفحص BCA وأكدته PAGE SDS. لا يتم التعبير عن واحدة من المتغيرات عند مستويات مرتفعة. كوم فيbination مع الشكل 1، يمكننا أن نستنتج أن هذا لم يكن بسبب نمو الخلايا الفرق ولكن نظرا لعدم التعبير البروتين الناجم بشكل صحيح. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> الشكل 3. نتيجة ممثلا لفحص النسخ. قمنا بقياس نشاط التحفيز من المتغيرات TFIIB على إنتاج النصوص فاشلة صغيرة من RNAP. هنا، تظهر آثار تحفيز مكتبة كاملة من الأحماض الأمينية واحد من بدائل بقايا TFIIB K87. وأكد على درجة عالية من تكرار الخطأ بنسب صغيرة. ويصور A جل عينة تبين أداء ثلاث طفرات بالمقارنة مع الضوابط wildtype، (WT) السلبية (NC) وشطف العازلة لا يسيطر سوى على تحتها.

<ol><li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li>
<li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+polymerase+factory%3A+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li>
<li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40(2008).</li>
<li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li>
<li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+Function+of+TFIIB%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li>
<li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li>
<li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li>
<li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li>
<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li>
<li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li>
<li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وتنقية البروتين المؤتلف الآلي الطريقة الموضحة هنا يسمح للإنتاج وتنقية لعدد كبير من البروتينات الطافرة في شكل صغير الحجم للغاية في ظل ظروف استنساخه مع الحد الأدنى من التدخل البشري. الشكلان 1 و 2 من النتائج عرض منهجية ضوابط الجودة وأمثلة من تنقية البروتينات. الشكل 3 يبين أن عوامل النسخ تنقية المستخدمة في هذا المثال تنفيذ استنساخه بطريقة غاية في المقايسات الفنية. على الرغم من وضعت إجراءات لتنقية TFIIB archaeal، فإنه ينطبق على نطاق واسع لتنقية البروتينات تقارب الموسومة. فإن استخدام مثل هذه البروتوكولات تنقية الآلي مما يسهل كثيرا من التحليل الكيميائية الحيوية للبروتينات المؤتلف وسيعزز بالتالي من فهمنا للبروتين البروتين التفاعلات على نطاق ويصعب تحقيق يدويا.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> بين عشية وضحاها اكسبرس متوسطة TB الفوري </td><td> ميرك كيماويات المحدودة </td><td> 71491-4 </td><td></td></tr><tr><td> FastBreak </td><td> Promega المحدودة </td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> Lysonase الكاشف التجهيز البيولوجي / 1 مل </td><td> ميرك كيماويات المحدودة </td><td> 71230 </td><td></td></tr><tr><td> مضاد الرغوة 204 </td><td> سيغما الدريخ المحدودة </td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHis ني الجسيمات </td><td> Promega </td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td> إيميدازول </td><td> سيغما الدريخ المحدودة </td><td> 56750 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma قاعدة </td><td> سيغما الدريخ شركاتأي المحدودة </td><td> 93362 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Bicinchoninic تقرير حمض البروتين </td><td> سيغما الدريخ المحدودة </td><td> BCA1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> بئر عميقة لوحة 2،2 مل ساحة ويلز PP pk10 </td><td> Anachem المحدودة </td><td> 1810-1800 </td><td></td></tr><tr><td> صفيحة ميكروسكوبية MicroWell 96 البوليسترين مسطحة القاع جيدا لم يعالج 12 كم من لوحات واضحة 5 0.4 مم 128 مل حجم 86 ملم X جيدا الحرارية العلمية نونك </td><td> فيشر العلمية المحدودة </td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td> صفيحة ميكروسكوبية الأزرق </td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> 24-RB حسنا كتل (24) </td><td> QIAGEN </td><td> 19583 </td><td></td></tr><tr><td> الجوانيدين هيدروكلوريد </td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> قابل للغسل إبرة لTheOnyx </td><td> Aviso شركة محدودة </td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td> الرف كاشف لالخرز المغناطيسي </td><td> Aviso شركة محدودة </td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td> لوحة قارئ التآزر HT </td><td> بيوتيك </td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td> الروبوتية منهاج TheOnyx 44OH/150/100 </td><td> Aviso شركة محدودة </td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td> صفيحة ميكروسكوبية شاكر Variomag Teleshaker </td><td> Inheco </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> 96-A جيدا نوع المغناطيس </td><td> QIAGEN </td><td> 36915 </td><td></td></tr></tbody></table>

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

البلورات بالأشعة السينية هو الطريقة المفضلة للحصول على عرض تفصيلي لبنية البروتينات. مثل هذه الدراسات تحتاج إلى أن تستكمل التحليلات الكيميائية الحيوية للحصول على مزيد من الأفكار التفصيلية في هيكل / وظيفة العلاقات. التقدم في تكنولوجيا توليف الجينات وقليل النوكليوتيد جعل استراتيجيات الطفرات واسعة النطاق من الممكن أكثر فأكثر، بما في ذلك استبدال بقايا الهدف من جميع الأحماض الأمينية الأخرى 19. مكسب أو خسارة، من بين الظواهر الدالة تسمح ثم لابد من استخلاص استنتاجات منهجية، مثل مساهمة خاصة لمخلفات النشاط التحفيزي الاستقرار البروتين، و / أو البروتين البروتين خصوصية التفاعل. من أجل أن تنسب الظواهر المختلفة لطبيعة الطفرة - بدلا من تقلب الظروف التجريبية - من المهم جدا لتنقية وتحليل البروتينات بطريقة يمكن التحكم بها وقابلة للتكرار. عالية الإنتاجية واستراتيجيات أتمتة البروتوكولات دليل علىخلقت الروبوتية معالجة السائل منصات الفرص لتنفيذ هذه الإجراءات المعقدة الجزيئية البيولوجية مع تدخل بشري قليلا ومعدلات الخطأ الحد الأدنى من 1-5. هنا، نقدم طريقة عامة لتنقية البروتينات المؤتلف صاحب الموسومة بطريقة عالية الإنتاجية. في دراسة حديثة، طبقنا هذا الأسلوب لتحقيق هيكل الوظائف مفصلة من TFIIB، وهو مكون من آلات النسخ القاعدية. أمر لا غنى عنه لTFIIB النسخ المروج-الموجهة في المختبر، كما أنها ضرورية لتوظيف بوليميراز RNA إلى مجمع preinitiation 6-8. TFIIB يحتوي على رابط مجال المرنة التي تخترق موقع نشط شق من بوليميريز RNA 9-11. يمنح هذا المجال رابط نشاطين قابلة للقياس الكمي كيميائيا على TFIIB، أي (أنا) وتحفيز للنشاط الحفاز خلال المرحلة &#39;فاشلة&#39; من بدء النص، و (الثاني) مساهمة إضافية إلىمحددة بوليميريز RNA توظيف في preinitiation معقدة 4،5،12. نحن استغلال طريقة تنقية عالية الإنتاجية لتوليد واحدة، استبدال مزدوجة وثلاثية والحذف الطفرات داخل رابط TFIIB وتحليل في وقت لاحق لهم في المقايسات الفنية للتأثير على تحفيز النشاط التحفيزي للبوليميراز RNA 4. تماما، ونحن ولدت، وتنقية وتحليل طفرات 381 - وهي مهمة كان يمكن أن يكون وقتا طويلا وشاقة لأداء يدويا. أنتجنا ويعاير البروتينات في multiplicates التي سمحت لنا أن نقدر أي اختلافات التجريبية وقدم لنا فكرة واضحة عن تكرار نتائجنا. هذه الطريقة بمثابة بروتوكول عام لتنقية البروتينات، وصاحب الموسومة وقد استخدم بنجاح لتنقية البروتينات المؤتلف أخرى. هو الأمثل حاليا هو لتنقية البروتينات من 24 ولكن يمكن تكييفها لتنقية البروتينات تصل إلى 96.

وصفنا طريقة لتنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف باستخدام السائل التعامل مع الروبوتات. هذه الطريقة تنطبق بصورة عامة على تنقية الصغيرة من البروتينات القابلة للذوبان صاحب الموسومة في شكل عالية الإنتاجية.

يُعد علم البلورات بالأشعة السينية الطريقة المفضلة للحصول على رؤية تفصيلية لبنية البروتينات. ويجب استكمال هذه الدراسات بـ...

الهدف من هذا الإجراء هو تنقية البروتينات المؤشبة ذات الوسم الهستيديني (his tagged proteins) بطريقة ذات إنتاجية عالية باستخدام بروتوكول مؤتمت على منصة روبوتية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق الإفراط في تعبير البروتينات في بكتيريا e coli باستخدام مزارع ذات أحجام صغيرة. بعد ذلك، يتم تحلل الخلايا كيميائياً لتحرير البروتينات التي ترتبط بدورها بحبيبات النيكل المغناطيسية.بعد ذلك، تُغسل الحبيبات لإزالة البروتينات الملوثة ولتعزيز نقاء البروتينات المطلوبة. وأخيراً، يتم تنقية البروتينات من الحبيبات المغناطيسية. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح تركيز البروتينات ونقاءها من خلال مقايسات BCA و SDS page ومقايسات وظيفية إضافية لتحديد نشاط البروتينات.تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتنا الآن على تنقية عدد كبير من البروتينات تحت ظروف متطابقة وبأقل قدر من التدخل. وهذا يتيح لنا تحقيق درجة عالية من قابلية التكرار، كما يقلل من الخطأ البشري. وتعد هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة أعداد كبيرة من الطفرات النقطية لبروتين معين، حيث تضمن أن التباين في نشاط البروتين يعود في الواقع إلى الطفرة وليس إلى الاختلافات في تحضير العينات.لتحضير المزارع البكتيرية طوال الليل، ابدأ بملء أطباق ذات 24 بئراً بالماء وتسخينها في الميكروويف لمدة دقيقتين لتعقيمها. تخلص من الماء ثم سخن الأطباق في الميكروويف مرة أخرى لمدة دقيقتين. باستخدام مستعمرات بكتيرية BL 21 Rosetta two غير محفزة ونموها حديث، أو مخزونات الجلسرول المجمدة، قم بتلقيح 1.5 milliliters من وسط التحفيز الذاتي الذي يحتوي على خليط من الجلوكوز واللاكتوز. خصص ثلاث آبار لكل من الضوابط الموجبة والسالبة، وبئراً واحدة للوسط فقط كضابط.قم بتنمية الخلايا بسرعة 250 RPM لمدة 18 ساعة عند درجة حرارة 37 °C. انزع الغطاء وضع الطبق على المنصة الروبوتية. تحتوي المنصة على ذراع قابضة لنقل الأشياء من موضع إلى آخر، وذراع ماصة، ومواضع متنوعة للأطباق والأحواض، بما في ذلك منصة رج، ومحرك خرزات مغناطيسي، ومنصة مغناطيسية.بالنسبة للأطباق ذات الـ 96 بئراً، قم بتحضير محاليل الغسل والتخفيف الخاصة بإجراء التنقية وفقاً للبروتوكول المكتوب، باستخدام 100 milliliters من الماء المقطر و 15 microliters من كاشف مضاد للرغوة. قم بتحضير محلول لتخفيف المزارع المحضنة طوال الليل لقياسات الكثافة الضوئية. قم بتحضير محلول تحلل يحتوي على كاشف fast break lyase و magnesium acetate، وقم بتحضير محلول مقايسة BCA للبروتين.نظرًا لميل TF two B إلى الالتصاق بإبر السحب، قم بتحضير محلول Guanidine hydrochloride بتركيز 6 M لغسلها. املأ أحواضًا أو أطباقًا بالحجم المناسب للمحاليل المنظمة الملائمة وضعها في مواقعها المخصصة مسبقًا على المنصة الروبوتية. ضع طبقًا واحدًا بـ 24 بئرًا لنفايات Guanidine hydrochloride، وطبقين شفافين بـ 96 بئرًا لقياسات OD 600 والامتصاصية، وطبقًا أزرق واحدًا بـ 96 بئرًا للبروتينات المنقاة.ضع طبق 96 بئراً عميقاً على الحامل المغناطيسي. استخدم الماء لتخفيف جزيئات النيكل المغناطيسية للشعر وأضفها إلى وحدة تحريك الخرز. قم بتشغيل التحريك للحفاظ على الخرز في حالة تعليق.قم بتشغيل المنصة الروبوتية وشطف إبر الماصات لعدة دقائق. ولإزالة الفقاعات الهوائية، ضع الطبق على منصة هزازة للتحقق من نمو المزارع الخلوية التي حُضنت طوال الليل. خفف 10 µL من المزرعة في 90 µL من محلول التخفيف مع غسل الماصات بين عمليات الإضافة.ثم قم بقياس الكثافة الضوئية عند OD 600 عندما تصل المزارع إلى كثافات متماثلة. انقل 100 µL من معلق خرزات النيكل المغناطيسية إلى آبار طبق ذو 24 بئراً، ثم انقل 900 µL من كل مزرعة إلى الآبار مع غسل الماصات بين الخطوات. بعد ذلك، أضف 100 µL من خليط fast break Lyase.ضع الطبق على منصة الرج بسرعة 800 RPM لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للخلايا بالتحلل ولبروتينات his tagged بالارتباط بالخرز لغسل الخرز. انقلها إلى طبق 96 well على حامل مزود بقضبان مغناطيسية تسحب الخرز بعيدًا عن مراكز الآبار، وتخلص من السائل العلوي واستخدم ستة mo iGuide hydrochloride لغسل رؤوس الماصة. بعد ذلك، أضف 500 µL من محلول الغسيل إلى آبار الـ 24.لوح الآبار وانقل العينات إلى لوح الـ 96 بئراً. ثم تخلص من الراشح. أضف 500 µL من محلول الغسل إلى الـ 96.لوح الآبار. انقل اللوح إلى الهزاز ورج اللوح بقوة لمدة دقيقة واحدة. ثم أعد اللوح إلى الحامل المغناطيسي، وأزل محلول الغسل.بعد الغسلة الأخيرة، أضف 100 µL من محلول الاستخلاص (elution buffer) إلى الحبيبات ورُج بقوة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم انقل المستخلص إلى طبق جديد. ولقياس كمية عينات البروتين، أضف 190 µL من كاشف BCA إلى آبار طبق شفاف مكون من 96 بئرًا، ثم أضف 10 µL من عينات البروتين إلى الآبار.تُحضن العينات لمدة خمس ساعات على الأقل ويُقاس الامتصاصية باستخدام مجموعة من معايير BSA. ثم تُخزن البروتينات عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. يوفر بروتوكول التنقية مرحلتين لمراقبة الجودة.يتم ذلك أولاً في مرحلة النمو البكتيري، ولاحقاً عند تقييم حصيلة البروتين. ومن خلال تنقية البروتينات في ثلاث مكررات، يمكن تحديد ما إذا كان أي تباين في المقايسات الوظيفية يعود إلى الأنماط الظاهرية الطافرة وليس نتيجة لتباينات تجريبية أو فشل في عمليات التنقية. تتراوح الحصيلة عادةً من 50 إلى 200 micrograms، وهي كافية تماماً للمقايسات الوظيفية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، فإنها تستغرق حوالي ثلاث ساعات فقط، وباستثناء تجهيز المنصة، وإعداد المزارع، ثم جمع البروتينات المنقاة، لا يوجد شيء آخر يتعين القيام به.بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء مقاييس وظيفية. وفي حالتنا هذه، ستكون هذه المقاييس عبارة عن مجموعة من مقاييس النسخ من أجل استقصاء كيفية تأثير طفرة TF two B على النشاط التحفيزي لـ ar polymerase.

high-throughput-purification-of-affinity-tagged-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وقد وضعت الرواية وكفاءة عالية من خطوتين تقارب بروتوكول اللوني ، ويوصف بالتفصيل. يستند هذا الأسلوب على علامة تنقية صغيرة مع اثنين من الصلات الكامنة وينطبق على طائفة واسعة من البروتينات الهدف مع خصائص مختلفة.

متعامد تنقية البروتين الميسر عن طريق بطاقات تقارب Bispecific الصغيرة

المصدر: بيكر، ب.، وآخرون. اختبار تقرير بسيط قائم على الفلورة لتحديد المكونات الخلوية المطلوبة لسلسلة سم الريسين A (RTA) في الخميرة. J. Vis. Exp. (2017).يوضح هذا الفيديو تنقية بروتين مؤتلف مزود بعلامات متعددة الهيستيدين باستخدام كروماتوغرافيا الألفة القائمة على النيكل. يوضح الخطوات الرئيسية، بما في ذلك تحلل البكتيريا عن طريق السونيكشن، وتوضيح وترشيح الليزات، والارتباط الانتقائي والاستبعاد للبروتين المستهدف باستخدام الإيميدازول.

 تقنية كروماتوغرافيا الألفة لتنقية بروتين بكتيري مؤتلف

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية كروماتوغرافيا تقارب النيكل لتنقية إنزيمات البيروفوسفوكيناز الموسومة بالهيستيدين من بكتيريا المطثية العسيرة.

تنقية البروتين القائم على كروماتوغرافيا النيكل: تقنية لتنقية البروتينات المؤتلفة الموسومة بالبولي هيستيدين من محللة الخلايا البكتيرية

يوضح هذا الفيديو تنقية التقارب الترادفي - وهي تقنية لتنقية مجمعات البروتين من الخلايا حقيقية النواة لدراسة تفاعل البروتين والبروتين. يحتوي المركب على بروتينين مصنفين بعلامات حاتمة مختلفة. عند تنقية المركب باستخدام راتنجين مع تقارب مع علامتين مختلفتين بطريقة متسلسلة ، فإن وجود كلا البروتينين في الغطاء يؤكد التفاعل بين الاثنين.

مقايسة تنقية التقارب الترادفي لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين

مجمعات البروتين تحفيز الوظائف الخلوية الرئيسية. مفصلة توصيف وظيفي وهيكلي للعديد من المجمعات الأساسية يتطلب إنتاج المؤتلف. MultiBac هو نظام خلية الفيروسة العصوية / الحشرات مصممة بشكل خاص للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة والمجمعات الخاصة بهم. تم تنفيذ MultiBac بمثابة منصة مفتوحة الوصول، وإجراءات التشغيل القياسية وضعت لتعظيم فائدتها.

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود نطاق صغير طريقة تنقية البروتين كفاءة عالية وفعالة من حيث التكلفة، والذي يسمح تنقية البروتينات المؤتلف من خلال الجمع بين فريد شطورة GST-علامة وصغيرة صاحب العلامة.

GST-صاحب تنقية: A خطوتين تقارب بروتوكول تنقية استسلام كامل طول البروتينات تنقية

يوصف بروتوكول للكمية، وارتفاع الإنتاجية التعبير فحص وتنقية التحليلية من البروتينات الانصهار من الثقافات على نطاق صغير القولونية وتطبيقه على التعبير عن أهداف البروتين المركب من السم حيوان ثاني كبريتيد الغنية.

عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في<em&gt; E. القولونية</em

ويرد إجراء ريفولدينج مجال ملزم يجند بيريبلاسميك dCACHE chemoreceptor والعطيفه الصائمية Tlp3 من إدراج الهيئات وتنقية تؤتي مليغرام كميات من البروتين.

الأسلوب كفاءة ريفولدينج وتنقية ليجند تشيموريسيبتور ملزمة المجال

يسمح محول لوحة متعددة الأعمدة الأعمدة الكروماتوغرافية لتكون واجهة مع لوحات جمع متعددة الآبار لتقارب مواز أو تنقية تبادل الأيونات توفير طريقة تنقية البروتين عالية الإنتاجية اقتصادية. ويمكن استخدامه تحت الجاذبية أو فراغ تسفر عن كميات ملليغرام من البروتين عن طريق الأجهزة بأسعار معقولة.

نظام تنقية البروتين عالي الإنتاجية اقتصادي ومتعدد الاستخدامات باستخدام محول لوحة متعدد الأعمدة

تتطلب الدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية لناقلات الأغشية البشرية كميات ملليغرام من البروتين المستقر والسليم والمتجانس. نصف هنا الطرق القابلة للتطوير لفحص ناقلات ناقلات المذاب البشري والتعبير عنها وتنقيتها باستخدام الجينات المحسنة للكودون.

التعبير عالي الإنتاجية وتنقية ناقلات المذاب البشري للدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية

توفر هذه المقالة إجراء لتنقية تقارب بروتين بشري مؤتلف ، رفرف نوكلياز 1 (FEN1) ، والذي تم تصنيفه بعلامة 6X-histidine . يتضمن البروتوكول استخدام عمودين أيونات معدنية متميزين لتنقية البروتين الموسوم.

تنقية تقارب بروتين 6X-his-tagged باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل سريع البروتين 

اكتشف طريقة تنقية عالية الإنتاجية للبروتينات المؤتلفة الموسومة بـ His في E. coli باستخدام منصة آلية. تضمن هذه التقنية قابلية التكرار وتقلل من الأخطاء البشرية في التجارب البيوكيميائية.

عالية الإنتاجية تنقية تقارب الموسومة البروتينات المؤتلف

استكشف المزيد من الفيديوهات