متعدد المعلمة قياس نفاذية المسام افتتاح المرحلة الانتقالية في القلب ماوس متفرقة الميتوكوندريا

الهدف من هذا الفيديو هو وصف إجراء لتوصيف انتقال نفاذية الميتوكوندريا. ضعف الفتح في الميتوكوندريا ، معزول عن قلب الفأر. أولا ، يتم عزل الميتوكوندريا عن قلوب الفئران.

باستخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي ، يتم بعد ذلك تقييم جودة الميتوكوندريا المعزولة باستخدام قطب أكسجين حراري متصل بجهاز كمبيوتر لقياس نسبة التحكم في الجهاز التنفسي وتقييم سلامة غشاء الميتوكوندريا. ثم باستخدام الأجهزة المترية الطيفية الفلورية ، يتم استخدام القياس المتزامن لمعالجة الكالسيوم ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا وحجم الميتوكوندريا لتحديد انتقال النفاذية. افتتاح ضعيف.

أظهرت البيانات الناتجة اختلافات في قدرة الاحتفاظ بالكالسيوم وانتقال نفاذية الميتوكوندريا. ضعف حساسية الميتوكوندريا المعزولة ، فتح انتقال نفاذية الميتوكوندريا. المسام هي ظاهرة معقدة تنطوي على تغييرات على عدة مستويات في فسيولوجيا الميتوكوندريا وتشريحها.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أن قياس معلمات متعددة في نفس الوقت يقدم صورة أكثر شمولا للظاهرة من قياس المعلمات الفردية وحدها ، مثل الكالسيوم أو التعبئة أو التورم قبل بدء الإجراء ، قم بإذابة المخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا وتحقق من درجة الحموضة ، والتي يجب أن تكون 7.4. ثم ضع جميع المخازن المؤقتة والأطباق والأنابيب التي سيتم استخدامها على الجليد. لاحظ أنه يجب تنفيذ جميع خطوات بروتوكول عزل الميتوكوندريا على الجليد.

ضع قلوب الفئران التي تعرضت للقتل الرحيم على طبق بتري واشطف أي دم بالميتوكوندريا الباردة. المخزن المؤقت للعزل. بعد ذلك ، انقل القلوب إلى طبق بتري جديد باستخدام شفرة ، وقم بإزالة الدهون والأذينين ، ثم فرم القلوب حتى يتم الحصول على منتج متجانس.

انقل القلوب المفرومة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف 10 ملليلتر من عازلة عزل الميتوكوندريا مع 0.1 ملليغرام لكل مليلتر تريبسين ، واترك العينة تهضم على الجليد لمدة 10 دقائق. لاحظ أن استخدام التربسين يزيد من غلة الميتوكوندريا المعزولة ويجب أن يظل ثابتا بين تحضير الميتوكوندريا.

ومع ذلك ، نوصي باختبار وظائف الميتوكوندريا المعزولة على المستحضرات التي تم الحصول عليها في حالة عدم وجود التربسين للتأكد من أن الإنزيم لا يتداخل مع أيوناتها. بعد الحضانة ، أضف 10 مل من عازل الميتوكوندريا الذي يحتوي على 0.1٪ خال من الأحماض الدهنية ، BS ، a ، وخمسة ملليغرام مثبط التربسين واخلطه عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات لتحييد التربسين ، استرجع الأنسجة المهضومة بسرعة منخفضة إلى متوسطة. الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة من أربع درجات مئوية.

بعد الدوران Resus ، قم بتعليق الأنسجة في ثمانية ملليلتر من عازل الميتوكوندريا مع 0.1٪ BSA الخالي من الأحماض الدهنية ، مع الحفاظ على العينة على الجليد. استخدم مجانس الرقص الآلي مع مدقة تفلون لتجانس العينة بأربعة إلى ستة تمريرات عند 1 ، 200 إلى 1 ، 400 دورة في الدقيقة. انقل المتجانس إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 800 مرة جم لمدة 10 دقائق من أربع درجات مئوية.

لحبيبات النوى وحطام الأنسجة. بعد الدوران ، استرجع السوبينات التي تحتوي على الميتوكوندريا في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وقم بطردها عند 8 ، 000 مرة G لمدة 15 دقيقة من أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، سيكون للحبيبات طبقة بيضاء فوقها.

استخدم نظام تفريغ لشفط الطبقة البيضاء بعناية وإزالتها أعلى حبيبات الميتوكوندريا. ثم أعد تعليق الحبيبات الداكنة المتبقية ، والتي تحتوي على الميتوكوندريا في مليلتر واحد من الميتوكوندريا. المخزن المؤقت للعزل.

بعد ذلك ، قم بعمل الطرد المركزي للميتوكوندريا عند 8 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق من أربع درجات مئوية. تخلص من سوبينات وأعد تعليق حبيبات الميتوكوندريا. في 150 ميكرولتر من الميتوكوندريا ، عازلة العزل ، حافظ على الميتوكوندريا على الجليد.

يتم قياس تنفس الميتوكوندريا المعزولة باستخدام قطب أكسجين حراري متصل بجهاز كمبيوتر ويتم التحكم فيه بواسطة الأكسجين. برنامج زائد ، يجب معايرة قطب الأكسجين في يوم التجربة. أضف اثنين من المليلتر من المخزن المؤقت لتنفس الميتوكوندريا يحتوي على تركيز نهائي من روتينون ميكرومولار واحد إلى أوكسي الغرفة ، وأغلق الغرفة وابدأ في تسجيل إشارة الأكسجين.

تتناسب الإشارة المسجلة بواسطة النظام والمعروضة على شاشة الكمبيوتر مع تركيز الأكسجين في غرفة أوكسي ثيرم. بمجرد أن تصبح إشارة الأكسجين مستقرة ، أضف 250 ميكروغراما من الميتوكوندريا وسجل التنفس القاعدي لمدة دقيقة واحدة. يجب أن يكون التنفس في هذه المرحلة منخفضا جدا لأن الميتوكوندريا تطمح إلى ركائز داخلية.

هذا هو التنفس في حالة واحدة. أضف السكسينات إلى التركيز النهائي البالغ خمسة مللي مولار لبدء تنفس الميتوكوندريا في المركب الثاني وسجل الإشارة لمدة دقيقة واحدة. يجب أن يزداد استهلاك الأكسجين أثناء التنفس في الحالة الثانية.

للحث على التنفس في حالة ، أضف DP إلى التركيز النهائي البالغ 150 ميكرومولار. في هذه المرحلة ، يجب أن يزداد استهلاك الأكسجين بسبب تخليق TP من خلال الفسفرة المؤكسدة. سجل الإشارة حتى يتباطأ التنفس مما يشير إلى استهلاك DP والانتقال إلى سجل التنفس في الحالة الرابعة.

الحالة الرابعة ، التنفس لمدة دقيقة واحدة على الأقل. أضف CCCP إلى تركيز نهائي قدره ميكرومولار واحد وسجل الإشارة لمدة دقيقة واحدة. في هذه المرحلة ، يجب أن يكون التنفس غير المقترن أقصى حدود.

احسب نسبة التحكم في الجهاز التنفسي بقسمة معدل استهلاك الأكسجين خلال الحالة الثالثة. التنفس بمعدل استهلاك الأكسجين خلال الحالة الرابعة ، يجب أن يكون التنفس المستهدف RCR أكبر من أربعة. بعد ذلك ، لتقييم سلامة غشاء الميتوكوندريا ، قم بتحفيز التنفس في الحالة الثالثة في عينة جديدة من الميتوكوندريا عن طريق إضافة DP إلى التركيز النهائي البالغ ملليمولار واحد.

ثم سجل استهلاك الأكسجين لمدة دقيقة واحدة ، وأضف 10 ميكرومولار سيتوكروم C وسجل استهلاك الأكسجين لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. نظرا لأن السيتوكروم C غير منفذ لأغشية الميتوكوندريا السليمة في تحضير جيد للميتوكوندريا ، فلن تكون هناك زيادة أو زيادة طفيفة جدا في التنفس. تشير الزيادة في التنفس إلى كسر أو تلف أغشية الميتوكوندريا.

تتكون أجهزة القياس متعدد المعلمات لفتح منفذ انتقال نفاذية الميتوكوندريا من كمبيوتر مقياس فلوري طيفي انبعاث مزدوج كمي رئيسي يتحكم فيه برنامج Felix GX. باستخدام برنامج Felix GX ، قم بإنشاء بروتوكول اكتساب متعدد الأبعاد وأدخل المعلمات لقياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا الكالسيوم وتورم الأصباغ المترية النسبة ، يقوم Forer و JC واحد بإنشاء الآثار المشتقة لنسبة و JC نسبة واحدة في مزيج من الميثامفيتامين رباعي الجوانب ACRL vete مع تركيز نهائي من روتينون ميكرومولار واحد ، خمسة مللي مولار سكسينات و 800 نانومولار. بالنسبة إلى FF ، أضف 250 ميكروغراما من الميتوكوندريا وضع العينة في حجرة العينة لمقياس الفلور اللطيفي.

ابدأ في تسجيل إشارات الفلورسنت بعد دقيقة واحدة ، وأوقف عملية الاستحواذ مؤقتا ، وأضف 500 نانومولار JC واحد ثم أعد تشغيل الاستحواذ. يجب أن تزداد إشارة نسبة واحدة JC مما يشير إلى امتصاص الميتوكوندريا النشطة. استمر في التسجيل حتى تصل إشارة JC إلى هضبة.

عادة في غضون خمس دقائق ، أضف كلوريد الكالسيوم إلى التركيز النهائي البالغ 20 ميكرومولار. يجب رؤية زيادة فورية في إشارة نسبة Fluor FF تمثل زيادة في وجود الكالسيوم في المخزن المؤقت للفحص ، متبوعا بانخفاض تدريجي بسبب امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا. يجب أن تظهر إشارة JC ذات النسبة الواحدة انخفاضا عابرا قصيرا يدل على إزالة استقطاب غشاء الميتوكوندريا الطفيف.

عندما تعود إشارة نسبة ER FF إلى المستوى القاعدي ، عادة في غضون دقيقة واحدة إلى 1.5 دقيقة عند 20 ميكرومولار أخرى من كلوريد الكالسيوم ، استمر في النبض على فترات محددة حتى لا تتمكن الميتوكوندريا من تراكم الكالسيوم وتبدأ في إطلاق الكالسيوم في المخزن المؤقت للمقايسة. يتم تصور فتح منفذ انتقال نفاذية الميتوكوندريا من خلال الزيادة المتزامنة في إشارة نسبة URA FF بسبب إطلاق الكالسيوم. انخفاض في نسبة إشارة JC الواحدة بسبب انهيار الغشاء المحتمل وانخفاض في تشتت الضوء بسبب تورم الميتوكوندريا أثناء عزلها من C 56 ستة فئران J سوداء.

كما هو موضح في هذا الفيديو ، تم قياس استهلاك الأكسجين بعد ذلك أثناء التنفس في الحالة الثالثة في وجود السكسينات و DP وأثناء التنفس في الحالة الرابعة بعد استهلاك DP كما هو موضح هنا ، تزيد إضافة DP من استهلاك الأكسجين بسبب الفسفرة المؤكسدة وتباطؤ استهلاك الأكسجين. بمجرد استهلاك كل DP ، يتم قياس استجابة الميتوكوندريا المعزولة للفصل بإضافة CCCP في وجود CCCP. معدل استهلاك الأكسجين أعلى مما كان عليه أثناء التنفس الثالث لتقييم سلامة الغشاء للميتوكوندريا المعزولة.

تم قياس استهلاك الأكسجين في وجود السكسينات و DP وبعد إضافة السيتوكروم C.As رأينا هنا ، فإن إضافة السيتوكروم C لا يزيد بشكل كبير من استهلاك الأكسجين فيما يتعلق ب DP والسكسينات مما يشير إلى أن أغشية الميتوكوندريا السليمة غير قابلة للاختراق للسيتوكروم C لتقييم انتقال نفاذية الميتوكوندريا ، وضعف الفتح في ميتوكوندريا القلب المعزولة كمؤشر على قدرة الميتوكوندريا على الاحتفاظ بالكالسيوم في الميتوكوندريا. انتقال نفاذية الميتوكوندريا. تم حدوث الفتح السيئ بسبب إضافات متسلسلة من 20 ميكرومولار.

تم قياس كلوريد الكالسيوم والكالسيوم الإضافي للميتوكوندريا وإمكانات الغشاء باستخدام المؤشرات المترية النسبة. تم قياس URA FF الموضح على أنه الأثر الأخضر و JC one الموضح على أنه تورم الأثر الأحمر للميتوكوندريا عن طريق تسجيل تشتت الضوء عند 525 نانومتر كما هو موضح بالتتبع الأسود. تم اختبار خصوصية JC واحد وإشارات التورم باستخدام ميكرومولار واحد ، CCCP وخمسة ميكروغرام لكل مليلتر من السم الميكروبي الإيثين كما يتضح هنا ، امتصاص الكالسيوم بواسطة الميتوكوندريا مصحوبا بإزالة استقطاب طفيف لغشاء الميتوكوندريا.

بعد أربع نبضات من الكالسيوم ، ينظر إلى فتح حوض انتقال نفاذية الميتوكوندريا على أنه زيادة في URA FF مما يشير إلى إطلاق الكالسيوم. انخفاض في JC واحد يشير إلى انهيار محتمل الغشاء وزيادة في حجم مصفوفة الميتوكوندريا ، والذي ينظر إليه على أنه انخفاض في تشتت الضوء كعلامة على التورم للتحقق من خصوصية فتحة منفذ انتقال نفاذية الميتوكوندريا. تم إجراء نفس القياسات في وجود السيكلوسبورين A ، الذي يرتبط بانتقال نفاذية الميتوكوندريا مكون سيكلو فيلين D.As الموضح في هذا الشكل ، فإن وجود راكب دراجة صغير مملة A يزيد من عدد نبضات كلوريد الكالسيوم المطلوبة لفتح انتقال نفاذية الميتوكوندريا PO مقابل عينة التحكم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم فتح منفذ انتقال نفاذية الميتوكوندريا في ميتوكوندريا القلب المعزولة. أصعب جانب في هذا الإجراء هو الحصول على الميتوكوندريا المعزولة ذات النوعية الجيدة. لذلك ، من المهم إجراء قياسات مراقبة الجودة قبل استخدام الميتوكوندريا لمزيد من التجارب.