متعدد المعلمة قياس نفاذية المسام افتتاح المرحلة الانتقالية في القلب ماوس متفرقة الميتوكوندريا

الهدف من هذا الفيديو هو وصف إجراء لتوصيف نفاذية المسام الميتوكوندرية. فتح المسام الضعيف في الميتوكوندريا المعزولة من قلب الفأر. أولاً، يتم عزل الميتوكوندريا من قلوب الفئران.

باستخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي، يتم بعد ذلك تقييم جودة الميتوكوندريا المعزولة باستخدام قطب أكسجين حراري متصل بجهاز كمبيوتر لقياس نسبة التحكم التنفسي وتقييم سلامة غشاء الميتوكوندريا. ثم باستخدام أجهزة القياس الطيفي الفلوري، تُستخدم القياسات المتزامنة لتعامل الكالسيوم، وجهد غشاء الميتوكوندريا، وحجم الميتوكوندريا لتحديد فتحية نفاذية الانتقال.

أظهرت البيانات الناتجة وجود اختلافات في قدرة الاحتفاظ بالكالسيوم ونفاذية الانتقال الميتوكوندرية. تُعد الحساسية المنخفضة للميتوكوندريا المعزولة، وانفتاح مسام نفاذية الانتقال الميتوكوندري، ظاهرة معقدة تتضمن تغيرات على مستويات عدة في فسيولوجيا الميتوكوندريا وتشريحها.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أن قياس معاملات متعددة في آن واحد يوفر صورة أكثر شمولاً للظاهرة مما يوفره قياس المعاملات الفردية وحدها، مثل الكالسيوم، أو التعبئة، أو التورم. قبل البدء في الإجراء، قم بإذابة منظم عزل الميتوكوندريا وتحقق من قيمة pH، والتي يجب أن تكون 7.4. ثم ضع جميع المنظمات والأطباق والأنابيب التي سيتم استخدامها على الثلج. لاحظ أنه يجب تنفيذ جميع خطوات بروتوكول عزل الميتوكوندريا على الثلج.

ضع قلوب الفئران التي تم قتلها رحيمًا في طبق بتري، واشطف أي دم موجود باستخدام محلول عازل الميتوكوندريا البارد. بعد ذلك، انقل القلوب إلى طبق بتري جديد باستخدام شفرة، وأزل الدهون والأذينين، ثم قم بتقطيع القلوب حتى يتم الحصول على منتج متجانس.

انقل القلوب المفرومة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. أضف 10 milliliters من محلول عزل الميتوكوندريا الذي يحتوي على 0.1 milligram per milliliter من tripsin، واترك العينة للهضم على الثلج لمدة 10 minutes. لاحظ أن استخدام trypsin يزيد من حصيلة الميتوكوندريا المعزولة ويجب الحفاظ على ثباته بين تحضيرات الميتوكوندريا.

ومع ذلك، نوصي باختبار وظائف الميتوكوندريا المعزولة في تحضيرات تم الحصول عليها في غياب التربسين للتأكد من أن الإنزيم لا يتداخل مع أيوناتها. بعد فترة التحضين، أضف 10 milliliters من محلول عزل الميتوكوندريا الذي يحتوي على 0.1%fatty acid-free, BS, a، وخمسة milligrams من مثبط التربسين، ثم اخلط عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. ولتحييد التربسين، قم باستعادة الأنسجة المهضومة عن طريق الطرد المركزي بسرعة منخفضة إلى متوسطة لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة أربعة degrees Celsius.

بعد عملية إعادة التعليق الناتجة عن الطرد المركزي، علّق النسيج في ثمانية ملليلتر من منظم عزل الميتوكوندريا المحتوي على 0.1% BSA خالي من الأحماض الدهنية، مع الحفاظ على العينة مبردة على الثلج. استخدم مجانس "دنسين" (Dounce) بمحرك ومكبس من التفلون لتجنيس العينة من خلال أربع إلى ست تمريرات بسرعة تتراوح بين 1,200 إلى 1,400 RPM. انقل المتجانس إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر وقم بإجراء الطرد المركزي عند 800 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

لترسيب النوى وبقايا الأنسجة. بعد عملية الطرد المركزي، يتم استعادة السائل الطافي الذي يحتوي على الميتوكوندريا في أنابيب طرد مركزي دقيقة، ثم يتم طردها مركزياً عند 8, 000 ×g لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. بعد عملية الطرد المركزي، ستظهر طبقة بيضاء فوق الراسب.

استخدم نظام شفط للتخلص بحذر من الطبقة البيضاء الموجودة فوق الراسب الميتوكوندري. بعد ذلك، أعد تعليق الراسب الداكن المتبقي، والذي يحتوي على الميتوكوندريا، في 1 mL من Mitochondrial Isolation buffer.

بعد ذلك، قم بطرد الميتوكوندريا مركزياً عند 8,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الميتوكوندريا في 150 µL من محلول عازل لعزل الميتوكوندريا، ثم احفظ الميتوكوندريا على الثلج.

يتم قياس تنفس الميتوكوندريا المعزولة باستخدام قطب أكسجين حراري متصل بجهاز كمبيوتر ويتم التحكم فيه بواسطة برنامج oxy. the plus، ويجب معايرة قطب الأكسجين في يوم التجربة. أضف 2 mL من محلول تنفس الميتوكوندريا المنظم الذي يحتوي على تركيز نهائي قدره 1 µM من الروتينون إلى غرفة oxy، ثم أحكم إغلاق الغرفة وابدأ في تسجيل إشارة الأكسجين.

تتناسب الإشارة التي يسجلها النظام وتظهر على شاشة الكمبيوتر طردياً مع تركيز الأكسجين في غرفة الأوكسي-ثيرم (oxy therm). وبمجرد استقرار إشارة الأكسجين، أضف 250 micrograms من الميتوكوندريا وسجل التنفس الأساسي لمدة دقيقة واحدة. يجب أن يكون التنفس في هذه المرحلة منخفضاً جداً لأن الميتوكوندريا تتنفس اعتماداً على الركائز الداخلية.

هذه هي الحالة الأولى من التنفس. أضف السكسينات بتركيز نهائي قدره 5 mM لبدء التنفس الميتوكوندري عند المعقد الثاني وسجل الإشارة لمدة دقيقة واحدة. يجب أن يزداد استهلاك الأكسجين خلال الحالة الثانية من التنفس.

لتحفيز تنفس الحالة، أضف DP بتركيز نهائي يبلغ 150 micromolar. عند هذه النقطة، يجب أن يزداد استهلاك الأكسجين نتيجة لتخليق TP من خلال الفسفرة التأكسدية. سجل الإشارة حتى يتباطأ التنفس، مما يشير إلى استهلاك DP والانتقال إلى تسجيل تنفس الحالة الرابعة.

الحالة الرابعة، التنفس لمدة دقيقة واحدة على الأقل. أضف CCCP ليصل التركيز النهائي إلى 1 µM وسجل الإشارة لمدة دقيقة واحدة. في هذه المرحلة، يجب أن يكون التنفس غير المقترن في حده الأقصى.

احسب نسبة التحكم التنفسي عن طريق قسمة معدل استهلاك الأكسجين أثناء التنفس في الحالة الثالثة على معدل استهلاك الأكسجين أثناء التنفس في الحالة الرابعة؛ حيث يجب أن تكون قيمة RCR المستهدفة أكبر من أربعة. بعد ذلك، ولتقييم سلامة الغشاء الميتوكوندري، قم بتحفيز التنفس في الحالة الثالثة في عينة جديدة من الميتوكوندريا عن طريق إضافة DP بتركيز نهائي قدره 1 millimolar.

بعد ذلك، قم بتسجيل استهلاك الأكسجين لمدة دقيقة واحدة، ثم أضف 10 micromolar من السيتوكروم C وسجل استهلاك الأكسجين لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. وبما أن السيتوكروم C لا ينفذ عبر أغشية الميتوكوندريا السليمة في تحضيرات الميتوكوندريا الجيدة، فلن تكون هناك زيادة أو ستكون هناك زيادة طفيفة جداً في التنفس. وتشير الزيادة في التنفس إلى وجود أغشية ميتوكوندريا مكسورة أو تالفة.

تتكون مجموعة الأجهزة المستخدمة للقياس متعدد المعلمات لفتح مسام انتقال النفاذية الميتوكوندرية من مقياس فلورية طيفي مزدوج الانبعاث quantum master يتم التحكم فيه بواسطة الحاسوب عبر برنامج Felix GX. باستخدام برنامج Felix GX، قم بإنشاء بروتوكول استحواذ متعدد الأبعاد وأدخل معلمات قياس جهد غشاء الميتوكوندريا الكالسيومي والانتفاخ للأصباغ النسبية Forer و JC-1، ثم قم بتوليد الرسوم البيانية المشتقة لنسبة Forer ونسبة JC-1 في طبق meth ACRL رباعي الجوانب يستخدم لمرة واحدة؛ امزج 1 mL من منظم مقايسة الميتوكوندريا بتركيز نهائي قدره 1 µM من rotenone و 5 mM من succinate و 800 nM من FF، ثم أضف 250 µg من الميتوكوندريا وضع العينة في حجرة العينات الخاصة بمقياس الفلورية الطيفي.

ابدأ بتسجيل الإشارات الفلورية بعد مرور دقيقة واحدة، ثم أوقف عملية الاستحواذ مؤقتاً، وأضف 500 nanomolar من JC-1، ثم استأنف عملية الاستحواذ. يجب أن تزداد إشارة نسبة JC-1 مما يشير إلى امتصاص الصبغة بواسطة الميتوكوندريا النشطة. استمر في التسجيل حتى تصل إشارة JC-1 إلى حالة الاستقرار (plateau).

عادةً، وفي غضون خمس دقائق، أضف كلوريد الكالسيوم ليصل إلى تركيز نهائي قدره 20 micromolar. يجب ملاحظة زيادة فورية في إشارة نسبة Fluor FF، مما يشير إلى زيادة وجود الكالسيوم في محلول الاختبار المنظم، يتبعها انخفاض تدريجي بسبب امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا. كما يجب أن تظهر إشارة نسبة JC one انخفاضاً عابراً قصيراً يشير إلى حدوث زوال استقطاب طفيف في غشاء الميتوكوندريا.

عندما تعود إشارة نسبة ER FF إلى المستوى الأساسي، وعادةً ما يكون ذلك في غضون دقيقة إلى 1.5 دقيقة عند إضافة 20 micromolar أخرى من كلوريد الكالسيوم، استمر في إعطاء النبضات على فترات زمنية ثابتة حتى لا تعود الميتوكوندريا قادرة على تراكم الكالسيوم وتبدأ في إطلاقه في محلول المقايسة المنظم. يمكن رؤية فتح مسام انتقال النفاذية الميتوكوندريا من خلال الزيادة المتزامنة في إشارة نسبة URA FF الناتجة عن إطلاق الكالسيوم. ويظهر ذلك من خلال انخفاض في نسبة إشارة JC one نتيجة لانهيار جهد الغشاء، وانخفاض في تشتت الضوء بسبب تورم الميتوكوندريا المعزولة من فئران C 56 black six J.

كما هو موضح في هذا الفيديو، تم قياس استهلاك الأكسجين أثناء تنفس الحالة الثالثة في وجود succinate و ADP، وأثناء تنفس الحالة الرابعة بعد استهلاك ADP كما يظهر هنا؛ حيث يؤدي إضافة ADP إلى زيادة استهلاك الأكسجين بسبب الفسفرة التأكسدية ثم يتباطأ استهلاك الأكسجين. وبمجرد استهلاك كل الـ ADP، يتم قياس استجابة المتقدرات المعزولة لفك الاقتران عن طريق إضافة CCCP؛ حيث يكون معدل استهلاك الأكسجين في وجود CCCP أعلى منه خلال تنفس الحالة الثالثة، وذلك لتقييم سلامة الغشاء للمتقدرات المعزولة.

تم قياس استهلاك الأكسجين في وجود السكسينات وDP وبعد إضافة السيتوكروم C. كما يظهر هنا، فإن إضافة السيتوكروم C لا تزيد من استهلاك الأكسجين بشكل ملحوظ بالنسبة لـ DP والسكسينات، مما يشير إلى أن أغشية الميتوكوندريا السليمة غير نفاذة للسيتوكروم C؛ وذلك لتقييم انتقال نفاذية الميتوكوندريا، وفتحة المسام الضعيفة في ميتوكوندريا القلب المعزولة كمؤشر على قدرة الميتوكوندريا على الاحتفاظ بالكالسيوم. انتقال نفاذية الميتوكوندريا. تم تحفيز فتحة المسام الضعيفة عن طريق إضافات متتالية بتركيز 20 micromolar.

تم قياس كلوريد الكالسيوم، والكالسيوم خارج الميتوكوندريا، وجهد الغشاء باستخدام المؤشرات النسبة. يظهر URA FF كأثر أخضر وJC one كأثر أحمر، بينما تم قياس انتفاخ الميتوكوندريا عن طريق تسجيل تشتت الضوء عند 525 nanometers والموضح بالأثر الأسود. تم اختبار خصوصية JC one وإشارات الانتفاخ باستخدام 1 µM من CCCP و5 µg/mL من السم الميكروبي ethin، وكما يتضح هنا، فإن امتصاص الكالسيوم بواسطة الميتوكوندريا يصاحبه إلغاء استقطاب طفيف لغشاء الميتوكوندريا.

بعد أربع نبضات من الكالسيوم، يظهر فتح مسام انتقال النفاذية الميتوكوندرية كزيادة في URA FF مما يشير إلى تحرر الكالسيوم. ويشير الانخفاض في JC one إلى انهيار جهد الغشاء وزيادة في حجم الماتريكس الميتوكوندري، وهو ما يظهر كتقليل في تشتت الضوء كعلامة على التورم للتحقق من خصوصية فتح مسام انتقال النفاذية الميتوكوندرية. وقد أُجريت القياسات نفسها في وجود cyclosporine A، الذي يرتبط بمكون مسام انتقال النفاذية الميتوكوندرية cyclo fillin D. وكما هو موضح في هذا الشكل، فإن وجود 1 µM من cyclist boring A يزيد من عدد نبضات calcium chloride المطلوبة لفتح مسام انتقال النفاذية الميتوكوندرية مقارنة بالعينة الضابطة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تقييم فتح مسام نفاذية الميتوكوندريا الانتقالية في الميتوكوندريا المعزولة من القلب. ويتمثل الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء في الحصول على ميتوكوندريا معزولة ذات جودة عالية؛ لذا، من المهم إجراء قياسات مراقبة الجودة قبل استخدام الميتوكوندريا في تجارب إضافية.