التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام في الرحم Electroporation
يوليو 26, 2012
توضح هذه المقالة بالتفصيل بروتوكول لelectroporate في الرحم قشرة الدماغ والحصين في E14.5 في الفئران. علينا أن نبين أن هذا هو وسيلة قيمة لدراسة التشعبات والعمود الفقري في هاتين المنطقتين الدماغي.
الهدف من هذا الإجراء هو استخدامه في الرحم ، والتثقيب الكهربائي ، لتصور التشعبات والعمود الفقري ومعالجتها وراثيا في القشرة الدماغية للفأر والحصين. يتم تحقيق ذلك عن طريق حقن محلول البلازميد المطلوب أولا في البطين الجانبي للأجنة في الرحم. بعد ذلك ، باستخدام مواضع مختلفة لأقطاب بالو.
وفقا لحقن الحمض النووي ، يتم إجراء مثقية كهربائية للقشرة الدماغية أو الحصين ، ثم مراحل ما بعد الولادة أو مرحلة البلوغ المرغوبة. الفئران منتشرة ويتم جمع العقول. أخيرا ، يتم تقسيم الأدمغة مع اهتزاز.
في النهاية ، يمكن تصور التشعبات والعمود الفقري باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. تقدم تقنية التثقيب الكهربائي الوحدوي العديد من المزايا مقارنة بطرق دراسة غير الأيمن والعمود الفقري. في الواقع ، تسمح هذه التقنية أولا بدراسة هذا الجانب مباشرة في الجسم الحي.
علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع توليد الفئران بالضربة القاضية في العملية الكهربائية ، يعد نهجا سريعا لدراسة تأثير قمع الجينات أو التعبير الجيني وعدم التعرض للبياض والعمود الفقري ، ليس فقط في بنية خلية معينة ، ولكن أيضا في نقطة محددة من التطور. يعد استخدام النظام المحفز في التشغيل الكهربائي الداخلي أيضا أداة مفيدة لتحديد التفاعل الوظيفي بين الجينات المشاركة في كتابة الدون وتطور العمود الفقري. في الواقع ، على عكس الفيروسات ، على سبيل المثال ، من الصعب علينا الجمع بين جين HNA متعدد أو أطنان متعددة في نفس مجموعة الخلايا للبدء في تخفيف الحمض النووي إلى التركيزات المطلوبة في الماء وإضافة صبغة خضراء سريعة إلى التركيز النهائي بنسبة 0.05٪ استخدم مجتذب دقيق لسحب الإبر الزجاجية للحقن.
ضع فأرة حامل في غرفة تحريض التخدير باستخدام الفلور وافتح الأكسجين حتى لترين في الدقيقة. عندما يفقد منعكس الكتابة ، انقله إلى قناع ما قبل الجراحة. ضع قطرة من IGEL على كل عين واستخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلق شعر البطن.
نظف المنطقة المحلوقة مرة واحدة باستخدام الكلورهيكسيدين لجمع الشعر المتطاير. انقل إلى قناع ثان في منطقة الجراحة مع ظهره على وسادة التدفئة. ابدأ الجراحة عند فقدان منعكس البتلة.
ارتد قناعا وقفازات معقمة وقم بتغطية بستارة معقمة. نظف المنطقة المحلوقة ثلاث مرات على الأقل باستخدام الكلورهيكسيدين. استخدم مشرطا لعمل شق عمودي على طول خط الوسط عبر الجلد.
باستخدام المقص. قم بعمل شق مماثل على عضلة البطن على طول الكوع الخطي. اختيار الأجنة الأكثر سهولة.
ضع ملقط دائري بين جنينين واسحب السلسلة الجنينية بعناية خارج تجويف البطن. من هذه النقطة فصاعدا ، حافظ على رطوبة الأجنة باستخدام PBS المعقم قبل التدفئة. باستخدام ملقط الحلقة.
تلاعب بموضع الجنين برفق داخل الكيس الأمنيوسي وتثبيت الرأس بين الحلقات. اضغط برفق لدفع الجنين لأعلى بالقرب من جدار الرحم. من ناحية أخرى ، خذ حامل الشعيرات الدموية وأدخل الإبرة بعناية في منتصف نصف الكرة الأرضية لاستهداف البطين الجانبي.
مع الحرص على تقليل حركة الإبرة على سطح جدار الرحم ، وتجنب ثقب الأوعية الدموية ، اضغط على الدواسة لحقن حوالي 0.5 ميكرولتر من محلول الحمض النووي الأخضر. ضع الأقطاب الكهربائية على جانبي رأس الجنين مع وجود دواسة موجبة على نفس جانب البطين المحقون للتثقيب الكهربائي للقشرة ، أو على الجانب الآخر من البطين المحقون ، التثقيب الكهربائي للحصين. ثم قم بتطبيق خمس نبضات كهربائية 30 فولت مدة 50 مللي ثانية على فترات ثانية واحدة.
تجنب تطبيق التيار عبر المشيمة لأن هذا سيؤدي إلى موت الجنين لزيادة فرص البقاء على قيد الحياة ، قم بحقن جميع الأجنة وتشغيلها كهربائيا في أقل من 30 دقيقة عند اكتمالها في PBS ، تجويف البطن ، واستخدم الملقط الحلقي لاستبدال قرن الرحم في موقعه الأصلي. استخدم خيوط فيكريل قابلة للامتصاص لإغلاق البطن والجدار والجلد. ضع في غرفة الاسترداد حتى يستيقظ.
ثم انقله إلى قفص على وسادة تدفئة بعد 24 و 48 ساعة من الجراحة. تحقق من سلوك الفأر لتقييم الألم أو المعاناة أو الضيق ، ووزن لتحليل الأدمغة. في مراحل ما بعد الولادة ، استخدم هزازا لتقسيم الأدمغة التي تم نفعها مسبقا وقم بتركيب الأقسام في حامل أكوا بولي لتصوير التشعبات والأشواك.
يوضح هذا الشكل أمثلة على الخلايا المثقبة بالكهرباء في القشرة الدماغية ، والتلفيف المسننة للحصين بينما تم تزويد الفئران من النوع بالكهرباء عند E 14.5 ، حيث تم حصاد بناء GFP والأدمغة في اليوم 14 بعد الولادة. عن طريق حقن كمية صغيرة من محلول الحمض النووي ، يتم تصنيف عدد قليل من الخلايا ، مما يسمح بتصور الشجرة الشجيرية للخلايا الموجبة ل GFP المعزولة ، بالإضافة إلى أشواكها بتكبير أعلى. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر حقن كمية صغيرة من الحمض النووي من أجل استهداف عدد قليل من الخلايا فقط ، ولكي تكون قادرا على تصور وتحديد كمية عدم الكتابة في العمود الفقري أو الخلايا العصبية الكهربائية.
الموجز
توضح هذه المقالة بروتوكولاً للكهربنة داخل الرحم للقشرة الدماغية والهيببوكامبس في الفئران في اليوم الجنيني 14.5. هذه الطريقة قيمة لدراسة التشعبات والتحدرات في مناطق الدماغ هذه.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء التنموي
- التلاعب الجيني
الخلفية
- الكهربنة تسمح بتصور والتلاعب الجيني بالعصبونات.
- تستهدف هذه التقنية مناطق معينة من الدماغ خلال التطور الجنيني.
- توفر مزايا على نماذج الفئران المعدلة جينيًا التقليدية.
- تتمكن دراسات في الجسم الحي من الكشف عن تفاعلات الجينات التي تؤثر على تطور التشعبات والتحدرات.
هدف الدراسة
- للتصور والتلاعب بالتشعبات والتحدرات في دماغ الفأر.
- لتقييم تأثيرات التعبير الجيني والقمع.
- لتطوير نهج سريع لدراسة الهياكل العصبية.
الطرق المستخدمة
- حقن الحمض النووي البلازميدي في البطين الجانبي للجنين.
- الكهربنة باستخدام الأقطاب الكهربائية لتوصيل النبضات الكهربائية.
- تقييم بنية الدماغ ووظيفته بعد الولادة.
- تصور التشعبات والتحدرات باستخدام الميكروسكوب المجسم.
النتائج الرئيسية
- كهربنة ناجحة للقشرة الدماغية والهيببوكامبس.
- تصور التشعبات التحدرية والتحدرات في الخلايا الإيجابية لـ GFP.
- تبيان فعالية التقنية للدراسات في الجسم الحي.
- تحديد تفاعلات الجينات المتضمنة في التطور العصبي.
الاستنتاجات
- الكهربنة داخل الرحم هي أداة قوية لدراسة الهياكل العصبية.
- تسمح هذه الطريقة بالتلاعب الجيني المستهدف في مناطق معينة من الدماغ.
- توفر بديلاً سريعًا لتقنيات التعديل الجيني التقليدية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
In utero electroporation (IUE) enables rapid, in vivo genetic manipulation and visualization of neuronal structures in the developing mouse brain, directly addressing the need for physiologically relevant models in early CNS drug discovery. This approach supports mechanistic de-risking and target validation by allowing precise temporal and spatial gene modulation in the cerebral cortex and hippocampus. IUE's flexibility accelerates hypothesis testing and portfolio triage for neurodevelopmental and synaptic function targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in neuronal development within native tissue environments.
- Supports functional target validation by permitting gain- and loss-of-function studies in specific brain regions and developmental windows.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing combinatorial gene manipulation in vivo.
- Accelerates predictive confidence for CNS target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares physiologically relevant neuronal systems for downstream phenotypic screening and quantitative imaging.
- Enables reproducible labeling of sparse neuronal populations for high-resolution dendrite and spine analysis.
- Supports assay standardization by providing consistent genetic delivery and expression in targeted brain regions.
- Improves screening readiness for compounds affecting synaptic structure or function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant neuronal architecture and gene expression patterns.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting inducible gene modulation at defined developmental stages.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers of dendritic and synaptic integrity.
- Reduces risk of late-stage attrition by modeling gene function in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
IUE integrates at the interface of early discovery and preclinical research, bridging in vitro findings with in vivo validation for CNS targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for genes regulating dendrite and spine development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of genetic or pharmacological interventions.
- Analytics: Enables high-content measurement of dendritic arborization and spine density in genetically defined neuronal populations.
- Translational Research: Facilitates alignment of preclinical models with human disease mechanisms by enabling precise temporal gene modulation.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable platform for rapid evaluation of multiple gene targets or combinations in the same experimental system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Offers rapid, scalable, and standardized genetic manipulation compared to traditional knockout models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early in vivo functional assessment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS programs based on robust in vivo data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic surgery, genetic construct design, and confocal imaging.
- Demands access to specialized instrumentation for microinjection, electroporation, and high-resolution microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of DNA delivery, electroporation parameters, and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or developmental stages.
- Limited to accessible brain regions and developmental windows as supported by the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Preparation: DNA Solution and Needles
2:10
Preparation: Surgery Before DNA Injection and Electroporation
3:25
Surgery: DNA Injection and Electroporation
5:01
Surgery: Post-surgical Evaluation and Tissue Processing
5:28
Representative Results
6:06
Conclusion
