التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام

يهدف هذا الإجراء إلى استخدام التثقيب الكهربائي في الرحم، لتصوير ومعالجة التغصنات والشوكات عصبياً في القشرة المخية والحصين لدى الفئران. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حقن محلول DNA البلازميد المطلوب في البطين الجانبي للأجنة داخل الرحم، ثم باستخدام وضعيات مختلفة لأقطاب Palo الكهربائية.

بناءً على حقن الحمض النووي DNA، يتم إجراء التثقيب الكهربائي للقشرة المخية أو الحصين، ثم الانتظار حتى الوصول إلى المراحل المطلوبة من فترة ما بعد الولادة أو مرحلة البلوغ. بعد ذلك، يتم تروية الفئران وجمع الأدمغة، وأخيرًا، يتم تقطيع الأدمغة باستخدام مقطع اهتزازي (vibram).

وفي النهاية، يمكن تصوير الشجيرات العصبية والأشواك باستخدام المجهر البؤري. وتوفر تقنية التثقيب الكهربائي أحادي الوحدة عدة مزايا مقارنة بالطرق المستخدمة لدراسة الشجيرات والأشواك غير المستهدفة. وبالفعل، تتيح هذه التقنية أولاً دراسة هذا الجانب مباشرةً داخل الجسم الحي (in vivo).

علاوة على ذلك، ومقارنةً بتوليد الفئران التي تعاني من تعطيل جيني (knockout mice)، يُعد الحقن الكهربائي (electroporation) نهجاً سريعاً لدراسة تأثير تثبيط الجينات أو التعبير الجيني في الزوائد الشجيرية والأشواك، ليس فقط في بنية خلوية محددة، بل وأيضاً في نقطة تطورية محددة. كما يمثل استخدام الأنظمة القابلة للتحفيز في الحقن الكهربائي أداة مفيدة لتحديد التفاعلات الوظيفية بين الجينات المشاركة في تطوير الزوائد الشجيرية والأشواك. وبالفعل، وعلى عكس الفيروسات على سبيل المثال، فإنه من الصعب علينا دمج جزيئات RNA متعددة أو جينات متعددة في نفس المجموعة من الخلايا. للبدء، قم بتخفيف DNA إلى التركيزات المطلوبة في الماء وأضف صبغة Fast Green بتركيز نهائي قدره 0.05%. استخدم ساحب الماصات الدقيقة (micro pipette puller) لسحب الإبر الزجاجية المخصصة للحقن.

ضع فأرة حاملاً في غرفة تحريض التخدير باستخدام isof fluorine وافتح تدفق الأكسجين حتى لترين في الدقيقة. وعندما يفقد الحيوان منعكس الرمش، انقله إلى قناع ما قبل الجراحة. ضع قطرة من IGEL على كل عين، واستخدم ماكينة حلاقة كهربائية لإزالة شعر البطن.

نظف المنطقة المحلوقة مرة واحدة باستخدام الكلورهيكسيدين لجمع الشعر المتطاير. انقل الحيوان إلى قناع ثانٍ في المنطقة الجراحية بحيث يكون ظهره على وسادة التدفئة. ابدأ الجراحة عندما يختفي منعكس بتلة القدم.

ارتدِ كمامة وقفازات معقمة وقم بتغطية الحيوان بغطاء جراحي معقم. نظف المنطقة المحلوقة ثلاث مرات على الأقل باستخدام الكلورهكسيدين. استخدم المشرط لإجراء شق عمودي على طول الخط الناصف عبر الجلد.

باستخدام المقص، يتم إجراء شق مماثل في عضلة البطن على طول المرفق الخطي، مع اختيار الأجنة الأكثر سهولة في الوصول إليها.

ضع ملاقط حلقية بين جنينين واسحب السلسلة الجنينية بعناية من التجويف البطني. ومن هذه النقطة فصاعداً، حافظ على ترطيب الأجنة باستخدام PBS معقم ومسخن مسبقاً. باستخدام الملاقط الحلقية.

قم بتحريك وضع الجنين بلطف داخل الكيس السلوي وثبّت الرأس بين الحلقات. اضغط برفق لدفع الجنين إلى الأعلى ليصبح أقرب إلى جدار الرحم. وباستخدام اليد الأخرى، أمسك حامل الشعيرية وأدخل الإبرة بعناية في منتصف نصف الكرة لاستهداف البطين الجانبي.

مع الحرص على تقليل حركة الإبرة عند سطح جدار الرحم، وتجنب ثقب الأوعية الدموية، اضغط على الدواسة لحقن حوالي 0.5 µL من محلول DNA الأخضر. ضع الأقطاب الكهربائية على جانبي رأس الجنين مع وضع القطب الموجب في نفس جانب البطين المحقون لإجراء التثقيب الكهربائي للقشرة المخية، أو في الجانب opposite للبطين المحقون لإجراء التثقيب الكهربائي للحصين. ثم طبق خمس نبضات كهربائية بجهد 30 volt ومدة 50 millisecond وبفواصل زمنية قدرها ثانية واحدة.

تجنب تمرير التيار الكهربائي عبر المشيمة لأن ذلك سيؤدي إلى موت الجنين. ولزيادة فرص البقاء على قيد الحياة، قم بحقن جميع الأجنة وإجراء الصدمات الكهربائية لها في أقل من 30 دقيقة، وعند الانتهاء، اغسلها بـ PBS، ثم ضعها في التجويف البطني، واستخدم ملقط حلقي لإعادة قرن الرحم إلى موقعه الأصلي. استخدم غرز Vicryl القابلة للامتصاص لإغلاق جدار البطن والجلد. ضع الحيوان في غرفة التعافي حتى يستيقظ.

ثم يتم نقله إلى قفص موضوع على وسادة تدفئة بعد 24 و48 ساعة من الجراحة. يتم فحص سلوك الفأر لتقييم الألم أو المعاناة أو الضيق، ووزن الحيوان لتحليل الأدمغة. وفي المراحل التالية للولادة، يُستخدم جهاز الاهتزاز (vibrator) لتقطيع الأدمغة التي سبق تعطيرها وتثبيتها لاحقاً، ثم تُثبت المقاطع في وسيط aqua poly mount لتصوير التغصنات والأشواك.

يوضح هذا الشكل أمثلة لخلايا تم إجراء التثقيب الكهربائي لها في القشرة المخية، والقشرة المخية، والتلفيف المسنن في الحصين في فئران من نوع type تم تثقيبها كهربائياً في المرحلة الجنينية E 14.5، حيث تم استخدام بنية GFP وحصد الأدمغة في اليوم الرابع عشر بعد الولادة. من خلال حقن حجم صغير من محلول DNA، يتم وسم عدد قليل من الخلايا، مما يسمح بتصور التفرع الشجيري لخلايا مفردة موجبة لـ GFP، بالإضافة إلى أشواكها عند تكبير أعلى. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر حقن حجم صغير من DNA من أجل استهداف عدد قليل فقط من الخلايا، وللقدرة على تصور وقياس don't write in the spine or the electro neuros.