فيفو السابقين تقييم من تعب، وانقباض في عضلات الهيكل العظمي تناوب متفرقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل عضلات سليمة وصحية لدراسة الوظيفة الانقباضية في المختبر (in vitro). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل العضلة الباسطة الطويلة لأصابع القدم (extensor digitorum longus) أو EDL والعضلة النعلية (soleus) أو sole السليمة من الفأر. وتتمثل الخطوة الثانية في ربط الأربطة والأوتار الخاصة بعضلتي EDL وsole باستخدام خيوط جراحية.

بعد ذلك، يتم تثبيت العضلات المعزولة على محول القوة وفي غرفة الانقباض. وتتمثل الخطوة النهائية في تحفيز العضلة بنبضات كهربائية مجالية لاستحثاث الانقباضات. وفي النهاية، يتم نقل القوى الناتجة إلى محول القوة وتسجيلها، حيث يمكن إجراء مختلف التدخلات الفسيولوجية والدوائية لمقارنة تأثيراتها على قدرة العضلة على الانقباض.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية لتقييم وظيفة العضلات، مثل قياس القدرة الانقباضية في الموقع (in situ)، ومعالجة الأداء الذكري، وغيرها، في أن هذه الطريقة تعزل المكونات العصبية والوعائية عن العضلة الهيكلية، مما يسمح بالتقييم المباشر للخصائص الجوهرية للعضلة المنقبضة. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن تشريح العضلات السليمة يتطلب إظهار مهارة ودقة وصبر عاليين. سيقوم بتنفيذ هذا الإجراء كل من الفني في مختبري وكي هول بارك، وهو زميل ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتور جيما.

يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة إجراء عملية تشريح العضلات وتثبيتها في غرفة الانقباض. لذا، يساعد هذا المقطع المرئي على فهم البنية التشريحية للعضلة وتقدير المقياس المطلوب لتثبيت العضلة المعزولة. في هذا الإجراء، يتم التضحية بفأر من نوع C 57 black six البري، أو نموذج فأر مصاب بمرض ما، عن طريق الخلع العنقي، ثم يوضع في الوضع الجانبي.

لتشريح العضلة الباسطة الطويلة لأصابع القدم (EDL)، قم بإجراء شق جلدي سطحي. اقطع اللفافة الموجودة بين عظم الظنبوب الأمامي والمجموعة العضلية الخلفية. حدد المنشأ القريب حيث يتصل الرباط باللقمة الوحشية لعظم الظنبوب وبالثلاثة أرباع العلوية من السطح الأمامي لعظم الشظية.

بعد ذلك، يتم قطع الرباط باستخدام مقص عيون دقيق في أبعد نقطة ممكنة عن العضلة لتحرير المنشأ القريب لعضلة EDL. بعد ذلك، يتم الإمساك بالرباط باستخدام ملقط غير مدبب وسحبه ببطء لتحرير عضلة EDL. قد يكون من الضروري قطع بعض الأنسجة المحيطة بعضلة EDL والعضلات الأخرى المحيطة بها.

يجب تنفيذ هذه الخطوة بدقة لتجنب إتلاف عضلة EDL. بعد ذلك، وعند منطقة الاندغام حيث تندغم الأوتار القاصية الأربعة في السلاميات الوسطى والقاصية للأصابع من الثاني إلى الخامس، يتم قطع الأوتار في أبعد نقطة ممكنة عن العضلات. ثم تُنقل عضلة EDL المعزولة إلى طبق تشريح يحتوي على محلول tyro متساوي التوتر وخالٍ من الكالسيوم.

تعد عضلة EDL عضلة تحللية سريعة ذات لون أبيض وردي باهت، ويبلغ طولها حوالي 10 إلى 13 مليمتر ووزنها من 8 إلى 11 مجم. بعد ذلك، اربط عقدة جراحية بإحكام عند كلا طرفي عضلة EDL المعزولة باستخدام خيوط جراحية مقاس 6، بحيث تكون العقدة بعيدة قدر الإمكان عن العضلة وأعلى قليلاً من منتصف طول الرباط أو الوتر. ثم انقل عضلة EDL إلى غرفة حمام الأنسجة المشبعة بالأكسجين.

قم بتثبيت العضلة في مجرى العينة الخاص بمحول القوة والخطاف الثابت في الجزء السفلي من غرفة الحمام. كرر عملية العزل والتثبيت لعضلة EDL من الساق الأخرى لتشريح العضلة الموجودة في الجانب الخلفي الوحشي من الساق. ادفع عضلة gastro التي تغطيها عادةً جانباً.

تعد العضلة النعلية عضلة تأكسدية بطيئة ذات لون أحمر داكن، وهي أقصر من العضلة الباسطة الطويلة للأصابع (EDL) بنحو مليمتر واحد، ولكنها تزن أكثر قليلاً من العضلة الباسطة الطويلة للأصابع (EDL). عند المنشأ القريب، اقطع الرباط الذي يتصل بالنصف القريب من الجزء الخلفي لعظمة الظنبوب على طول خط العضلة النعلية، وبالثلث القريب من الجزء الخلفي لعظمة الشظية.

بعد ذلك، عند موضع الاندغام القاصي، اقطع وتر العقب الذي يندغم في الجزء الخلفي من عظم العقب. قم بتحرير العضلة النعلية بعناية بعد ذلك. ثبت العضلة النعلية بشكل صحيح في غرفة الحمام.

بمجرد تثبيت العضلات في غرف حمامات أنسجة منفصلة، ابدأ بتسجيل البيانات. تذكر تصفير خط الأساس لمحول القوة؛ حيث سيسهل ذلك ملاحظة التغيرات في خط الأساس وتبسيط مقارنة انقباضات العضلات عبر الظروف التجريبية المختلفة.

بعد ذلك، يتم تحفيز العضلات المعزولة بنبضات موجية مربعة. استخدم تيارات كهربائية تتراوح من 60 إلى 300 milliamps، وتتراوح مدة النبضة الموجية المربعة الفردية بين 0.3 و1 millisecond، وتتراوح مدة قطار التحفيز بين 350 أو 500 أو 1000 milliseconds. الخطوة التالية هي اختيار تردد تحفيز قادر على إنتاج أقصى قوة تيتانية (titanic force) عندما يتم تمديد العضلة المعزولة عند طولها الأمثل في درجة حرارة الغرفة.

يكون هذا التردد عادةً حوالي 100 hertz لعضلة EDL و60 hertz. بالنسبة لعضلة soleus، قم بتمديد العضلة ببطء وانتظر لمدة 30 seconds، ثم حفزها بتردد 100 hertz أو 60 hertz. بعد ذلك، قم بتمديدها مرة أخرى.

انتظر لمدة 30 ثانية أخرى ثم قم بتحفيزها مرة أخرى عند التمدد. إذا لم تزد القوة أكثر من ذلك، فهذا يعني عادةً أنه قد تم الوصول إلى القوة القصوى. وفي الوقت نفسه، عند تكرار دورات التمدد والتحفيز، يشير انخفاض القوة إلى أن العضلات قد تمددت بشكل مفرط. في هذه الحالة، قم بإرخاء العضلة إلى مستوى التمدد السابق وحفز العضلة مرة أخرى حتى يتم رصد القوة القصوى.

الآن، استخرج العلاقة بين القوة والتردد. قم بتحفيز العضلة بترددات تتراوح من 1 إلى 140 hertz بزيادات قدرها 5 إلى 10 hertz وبدورية تتراوح من 30 إلى 60 seconds. عند إجراء التجارب في درجة حرارة 25 °C، وفي حال إجراء التجارب في درجة حرارة 37 °C، قم بتوسيع نطاق FF ليشمل ترددات أعلى تصل إلى 300 hertz لعضلة الحجاب الحاجز، ومن 180 إلى 200 hertz لعضلة soleus ومن 220 إلى 250 hertz لعضلة EDL.

بعد ذلك، ومن خلال مقارنة مقدار القوة الناتجة عن كل تردد من ترددات التحفيز، حدد التردد الذي يولد أقصى قوة تيتانية (titanic force) والتردد الذي يولد ما يقرب من نصف أقصى قوة تيتانية. يوفر Tmax معلومات مهمة حول تعديل الآلية التقلصية، بينما يوفر نصف Tmax معلومات أكثر صلة بتنظيم الكالسيوم وعملية الاقتران الاستثاري التقلصي (ECC process).

يتم بعد ذلك تحفيز العضلة بتردد tmax على فترات زمنية مدتها دقيقة واحدة لمدة 30 دقيقة، وهي عملية تُسمى التوازن (equilibration) لدراسة مساهمة الشبكة الساركوبلازمية. ولتقييم إطلاق الكالسيوم وتأثيره على انقباض العضلات بعد عملية التوازن، يتم إجهاد العضلات عن طريق تقديم تحفيز بقيمة نصف Tmax على فترات زمنية مدتها ثانيتان لمدة خمس دقائق. وقد استخدمنا هنا مدة قطار تحفيز تبلغ 500 milliseconds، وبالتالي تكون دورة التشغيل 25%، ثم يتم استعادة العضلة بتحفيز بقيمة نصف Tmax على فترات زمنية مدتها دقيقة واحدة.

يمكن إجراء بروتوكول إرهاق إضافي لمدة 30 دقيقة أو حتى تستقر القوة. ويُعتقد الآن أن استخدام إرهاق tmax عند Tmax يختبر بدقة حالة الآلية التقلصية. بعد ذلك، تُكرر الإجراءات المتبعة للحصول على FF حتى يمكن ملاحظة الاختلافات المظهرية بين السلالات المختلفة، أو نماذج الأمراض، أو العلاجات الدوائية.

لتحليل قوة الفشل (FF) قبل وبعد الإجهاد لاستقصاء مساهمة دخول الكالسيوم خارج الخلوي في انقباض العضلات، يمكن تغيير محلول الغمر إلى محلول لا يحتوي على الكالسيوم، ولكن يحتوي على 0.1 millimolar من EGTA. وبدلاً من ذلك، يمكن إضافة حاصرات مختلفة للقنوات التي تعمل بتشغيل المخازن في محلول الغمر. وفي نهاية التجربة، قم بقياس الطول التجريبي للعضلات، ثم زن كل منها على حدة باستخدام ميزان تحليلي، ثم قم بتجميد العضلات سريعاً في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة حرارة minus 80 °C لإجراء التحليلات الكيميائية الحيوية.

الآن، قم بمعايرة محول طاقة القوة. حوّل قوة العضلة المسجلة من الميلي فولت إلى جرام قوة بناءً على نتائج المعايرة. ثم قم بتنميطها بالنسبة لمساحة المقطع العرضي الفسيولوجية.

يُظهر هذا الشكل قوى الانقباض الناتجة عن تردد 5 هرتز، و20 هرتز، وقوة التكزز القصوى؛ حيث يظهر هنا مخطط لقوة الانقباض في عضلة تالفة. وهذا مثال تمثيلي يوضح الانقباضات الفردية لعلاقة القوة مقابل التردد في عضلة EDL والمنحنى المرسوم الناتج عن هذه العلاقة. هذا ملف تعريف إجهاد يتميز بتراجع سريع نموذجي لعضلة EDL، وملف تعريف إجهاد يتميز بتراجع بطيء لعضلة sole.

يؤدي التحفيز المجهد إلى ظهور بدائل ميكانيكية في العضلة المعطلة ذات خصائص مناولة الكالسيوم المضطربة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعتين. وإذا تم تنفيذها بشكل صحيح، فإن التجربة بأكملها ستستغرق وقتًا أطول وستعتمد على عدد التدخلات التي يتم إجراؤها. وأثناء محاولتك القيام بهذا الإجراء، من المهم جدًا عزل وتثبيت عضلة DL بأسرع وقت ممكن لأن بيئة المختبر منخفضة الأكسجين قد تسبب ضررًا غير قابل للإصلاح في كل عضلة سريعة.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليل الجينات، وبصمة ويسترن، والكيمياء النسيجية المناعية والدراسات البنيوية على نفس العضلات التجريبية للإجابة على أسئلة إضافية. على سبيل المثال، مستوى تعبير وتمركز بروتين معين أو مكونات البروتينات العضلية التي تنظم التقلص أو إشارات الكالسيوم، بالإضافة إلى التغيرات المورفولوجية أو البنيوية الدقيقة في العضلات الناتجة عن ظروف محددة بعد تطورها. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال فسيولوجيا العضلات لاستكشاف العيوب الجينية التي تؤثر على وظيفة العضلات الهيكلية في نماذج مختلفة، بما في ذلك الفئران والجرذان والهامستر.