غيروي ثلاثي الأبعاد في المختبر نمذجة التفاعلات اللحمية-طلائي سرطان المبيض خلال بدء والتقدم

الهدف العام من التجربة التالية هو إنشاء نماذج نموذجية ثلاثية الأبعاد لتطور سرطان المبيض في المرحلة المبكرة. أولا ، قم بإنشاء خطوط الخلايا الخالدة H turt المشتقة من الأنسجة الظهارية المبيضية الطبيعية والخلايا الليفية الأولية. ثم لإعادة إنشاء الهندسة المعمارية في الجسم الحي وتفاعلات الخلايا الخلوية المعقدة الموجودة في الثقافة المشتركة للمبيض ، تشرع خطوط الخلايا الظهارية واللحمية في النماذج الكروية ثلاثية الأبعاد S في إصلاح وتلطيخ الثقافات العضوية وتحليل التعبير عن علامات محددة من أجل دراسة السمات الجزيئية للتفاعلات الظهارية اللحمة.

تظهر النتائج التي تم الحصول عليها كيف يمكن أن تؤثر التعديلات في حجرة الخلايا اللحمية للنماذج النموذجية ثلاثية الأبعاد على النمط الظاهري للخلايا الظهارية المزروعة بشكل مشترك. يمكن أن تساعد النماذج النموذجية ثلاثية الأبعاد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث سرطان المبيض ، مثل استكشاف أصول هذا المرض وتوضيح دور البيئة المكروية اللحمية في بدء الورم وتطوره. تمتد تطبيقات هذه التقنيات نحو تشخيص الأمراض وعلاجها مقارنة بطرق الزراعة ثلاثية الأبعاد الأخرى.

يمكن تطبيق هذه التقنية على مجموعة واسعة من أحجام زراعة الخلايا والتطبيقات النهائية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الثقافات ثلاثية الأبعاد والثقافات النموذجية لاختبار المخدرات في المختبر. يمكن أيضا تطبيق هذا النهج على أنظمة نموذجية أخرى ، كما هو الحال في دراسة أنواع الأورام الصلبة الأخرى أو في الأمراض الحميدة.

نقل أنسجة المبيض الطازجة إلى مختبر زراعة الخلايا في وسط نمو الخلايا الليفية المبيضية الطبيعية الخالدة مع استكمال المضادات الحيوية الإضافية والغريبة. اغسل العينة ثلاث مرات بخمسة ملليلتر من PBS لإزالة أي خلايا ظهارية تظل ملتصقة بشكل فضفاض بالأنسجة. بعد ذلك ، انقل العينة بالإضافة إلى PBS إلى طبق ثقافة P 100 نظيف باستخدام أدوات معقمة ، انقل الأنسجة إلى طبق ثقافة نظيف جاف ثان P 100.

قطع الأنسجة إلى قطع 0.5 سم مربع ونقل كل قطعة إلى طبق P 100 منفصل. استمر في تقطيع الأنسجة إلى قطع أقل من ملليمتر مربع واحد. ثم أضف 20 مل من وسائط INOF GM ومراقبة الثقافة لنمو الخلايا باستخدام الفحص المجهري الطوري.

تأكد من أن الخلايا تلتصق بالطبق في غضون 24 ساعة. مراقبة نمو الخلايا باستخدام الفحص المجهري الطوري عادة ما تلتصق الخلايا بالطبق في غضون 24 ساعة بعد أسبوع. قم بإزالة أي أنسجة غير ملتصقة عن طريق الشفط ، وتجديد الوسائط وبعد ذلك أعد تغذية المزارع مرتين في الأسبوع في غضون أسبوع إلى ثلاثة أسابيع عندما يبلغ حجم مستعمرات الخلايا حوالي 500 ميكرون.

عزل المستنسخة باستخدام الرحلات وأقراص الاستنساخ المطلية. من أجل تأكيد الخلايا الليفية بنسبة 100٪. ضع عينة من خط الخلية على زلات الغطاء الزجاجي وقم بإجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي للحصول على علامة الخلايا الليفية وعلامة الظهارة وعلامة الخلية البطانية.

قبل يوم واحد من نقل الفيروسات القهقرية لممر H Turt ، تعزل خلية الخلايا الليفية المبيضية الطبيعية من طبق P 100 واحد إلى ثلاثة أطباق P 100. يمكن شراء أو إنتاج ناتان الفيروسي المصنوع مسبقا داخليا باستخدام البروتوكولات القياسية لتعداء المهد لخلايا HEC 2 9 3 T. لتحضير محلول بولي هيما ، قم بوزن 1.5 جرام بولي هيما ، وضعه في زجاجة معقمة.

أضف 95 مل من البيولوجيا الجزيئية ، والدرجة ، والإيثانول المطلق ، وخمسة ملليلتر من الماء المقطر من درجة زراعة الخلايا. ضع محلول بولي هيما في حمام مائي على حرارة 65 درجة مئوية حتى يذوب تماما. قم بتغطية أطباق زراعة المناديل بمحلول بولي هيما الطازج.

جفف أطباق زراعة الخلايا بالهواء داخل غطاء التدفق الرقائقي. يمكن استخدام التأرجح اللطيف على منصة هزاز لضمان طلاء متساو للأطباق أو القوارير ذات الحجم الأكبر. إذا جف محلول البوليوس بسرعة كبيرة ، فلن يكون السطح أملسا.

إذا رغبت في ذلك ، قم بمعالجة الخلايا الليفية قبل الثقافة ثلاثية الأبعاد ، على سبيل المثال ، لتحريض الشيخوخة ، وقم بمعالجة الخلايا بجرعات مميتة من بيروكسيد الهيدروجين. استعادة وتوسيع INOF وثقافات الخلايا الظهارية في المختبر لإعداد خلايا كافية لإنشاء المنشطات غير المتجانسة 3D. بعد خمس دقائق من غسل PBS ، أضف 15 مل من الوسط إلى طبق بولي هيما.

في هذه الأثناء ، أضف التربسين إلى خلايا الخلايا الليفية المبيضية الطبيعية الخالدة لفصلها عن طبق الثقافة. بعد ثلاث إلى خمس دقائق ، قم بتحييد التربسين بحجم متساو من وسائط الاستزراع وحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط خمسة ملليلتر واخلطها جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل أو الدوامة برفق.

ثم استخدم عينة سعة 10 ميكرولتر لتعداد الخلايا القابلة للحياة باستخدام trian blue. أضف الآن 4 ملايين خلية INOF إلى الوسط الذي تم توزيعه بالفعل في اللوحة المطلية ببولي هيما. اصنع حجم وسائط الاستزراع إلى 20 مل واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

مراقبة التجميع الخلوي في الستيرويد متعدد الخلايا عن طريق الفحص المجهري الطور لإعادة تغذية الثقافات الكروية S كل يومين إلى ثلاثة أيام. ضع الألواح بزاوية على ماصة. اسمح للكرات بالاستقرار وإزالة حوالي 16 مل من الوسائط المستنفدة بعناية باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر.

أضف 16 مل من الوسط الطازج إلى الثقافة والعودة إلى الحاضنة في اليوم السابع. قم بإنشاء ثقافات نمطية غير متجانسة عن طريق إضافة الخلايا الظهارية إلى الخلايا الليفية phe. أولا ، قم بإعداد معلقات الخلايا الظهارية للمبيض بواسطة التربسين كما هو موضح سابقا بعد تعداد الخلايا.

يغسل مرة واحدة في وسط INOF GM لمنع انتقال أي عوامل نمو من وسط النمو الظهاري. بعد تجديد وسط مزارع الخلايا الليفية ، أضف الخلايا الظهارية بنسبة أربعة إلى واحد من الخلايا الليفية إلى زراعة الخلايا الظهارية. ال OIDs غير المتجانسة في INOF GM إعادة تغذية الثقافات النموذجية كل يومين إلى ثلاثة أيام لمدة 14 يوما إضافية.

بالنسبة للكيمياء الهيستولوجية المناعية ، قم بإصلاح PHE بفورمين مخزن محايد ، وحبيبات PHE واستبدل الفورمالين بنسبة 70٪ من الإيثانول. انتقل إلى المعالجة في البارافين باستخدام البروتوكولات القياسية المستخدمة للأنسجة البشرية. يمكن تقسيم الستيرويدات المدمجة في البارافين وتلطيخها ب h و e من علامات جزيئية محددة باستخدام كيمياء المناعة.

بدلا من ذلك ، اغسل المنشطات في PBS وقم بإصلاحها في 4٪ بارا فورمالديهايد. ثم قم بتضمين العينات في وسط OCT والتجميد المفاجئ لتقسيم ناظم التبريد وتلوين الفلورسنت المناعي لتحليله عن طريق قياس التدفق الخلوي. اغسل المنشطات في PBS وفصلها عن طريق هضم التربسين أو Accutane عند 37 درجة مئوية.

يمكن تعزيز التفكك الكامل للمنشطات في معلق خلية واحدة عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل بطرف ماصة سعة مليلتر واحد. احرص على عدم تكبير حجم الخلايا ، وقم بتحييد التفاعل بحجم متساو من وسط الثقافة وإزالة كتل الخلايا عن طريق تمرير المعلق عبر مصفاة خلية من 40 إلى 70 ميكرون. ثم قم بتكسير الخلايا وغسلها باستخدام PBS وتعداد إعادة تعليق العدد المطلوب من الخلايا في الحقائق العازلة والبقع وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في مختبرنا ، قمنا بتحويل الخلايا الظهارية للمبيض جزئيا وشاركنا في زراعة هذه الخلايا مع الخلايا الليفية المبيضية الطبيعية والشيخوخة لتقليد تطور سرطان المبيض في مراحله المبكرة.

في مبيض ما قبل انقطاع الطمث ، يظهر تلطيخ الفلورسنت المناعي للأرومات الليفية المبيضية الطبيعية الخالدة أن كلا من الخلايا الليفية المبيضية الطبيعية الأولية والخلايا الليفية المبيضية الطبيعية الخليدة عبرت عن بروتين خاص بالخلايا الليفية ، لكنها لا تعبر عن السيتوكيراتين سبعة والتعبير عن مينتون. تظهر خلايا الخلايا الليفية المبيضية الطبيعية المزروعة بمفردها في شكل ثلاثي الأبعاد PHE مورفولوجيا مغزلة ومصفوفة وفيرة خارج الخلية. هنا ، تعرضت الخلايا الليفية المبيضية الطبيعية لبيروكسيد الهيدروجين للحث على الشيخوخة على مدى سبعة أيام ثم تمت زراعتها بخلايا ظهارية المبيض المحولة جزئيا لمدة 14 يوما.

للتمييز بين نوعي الخلايا ، تم تلطيخ المنشطات الناتجة بالمناعة ل mim one كعلامة انتشار وعموم السيتوكيراتين كعلامة ظهارية. يشير القياس الكمي للبيانات إلى أن البيئة المكروية للشيخوخة تعزز السمات الورمية للخلايا الظهارية المحولة جزئيا ، في حين أن البيئة المكروية الطبيعية تمنع تطور الأورام ، والسمات النسيجية للخلايا الطبيعية والخبيثة التي لا يمكن اكتشافها عند زراعة الخلايا كطبقات أحادية اليستمر. عندما يتم نقل الخلايا إلى ثقافة كروية ، على سبيل المثال ، يمكن اكتشاف السمات النسيجية لسرطانات المبيض ذات الخلايا الصافية في الثقافات ثلاثية الأبعاد لخطوط خلايا سرطان المبيض ذات الخلايا الصافية ، ولكن ليس في الثقافات أحادية الطبقة لنفس الخلايا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد ثقافات نموذجية ثلاثية الأبعاد لدراسة التفاعلات بين الخلايا الظهارية واللحمة. خلال نشأة الورم المبكرة. عند إعداد ثقافة ثلاثية الأبعاد ، من المهم ضبط أرقام الخلايا وفقا للتطبيق النهائي ، مما يسمح ببعض فقدان المواد أثناء المعالجة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إعداد الثقافات ثلاثية الأبعاد في ساعة واحدة بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي جنبا إلى جنب مع توصيف الأشعة الدقيقة للتعبير الجيني لتحليل تغيرات التعبير الجيني العالمية التي تحدث في الثقافات النمطية ثلاثية الأبعاد ولكن لا يتم اكتشافها في ظل ظروف الثقافة أحادية الطبقة. سيمكن ذلك من تشريح مسارات الإشارات ثنائية الاتجاه التي تحدث على وجه التحديد في ظل ثقافة أساسية ثلاثية الأبعاد. البيئة الجزئية.