التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

الهدف العام من التجربة الموضحة في هذا الفيديو هو تقييم ما إذا كان الببتيد المضاد للميكروبات يلعب دورا في تحسين التهاب القولون الناجم عن كبريتات ديكستران في الفئران. يتم تحقيق ذلك عن طريق حقن نخاع العظام من الفئران البرية إلى الفئران المشعة ونخاع العظام من الفئران بالضربة القاضية إلى الفئران البرية المشععة. سيولد نخاع العظم المزروع خلايا دم جديدة في متلقي النمط الجيني للمتبرع.

ثم تتعرض الفئران المتلقية لكبريتات ديكستران للحث على التهاب القولون بعد أربعة أسابيع. يتم التحقق من صحة الزرع الناجح عن طريق قياس التدفق الخلوي ويتم تقييم تلف أنسجة القولون عن طريق الأنسجة. يتم الحصول على النتائج التي تظهر أن التهاب القولون قد تم تحسينه عند زرع نخاع العظم من النوع البري في الفئران بالضربة القاضية.

على العكس من ذلك ، يزداد التهاب القولون سوءا عندما يتم زرع نخاع العظم بالضربة القاضية في الفئران البرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تحديد التعبيرات الجينية من الخلايا المشتقة من نخاع العظام أو الخلايا غير المشتقة من نخاع العظم في الالتهاب أو العدوى. يوصى باستخدام الفئران بالضربة القاضية C 57 و Black Six و Wild Type و C لهذه التجربة لتسهيل تتبع الفئران البرية والفئران بالضربة القاضية.

الخلايا المانحة بعد زراعة نخاع العظم. استخدم الفئران CD 45.1 لتمثيل الفئران البرية و CD 45.2 للفئران بالضربة القاضية. يصف الرسم البياني الموضح هنا الإعداد التجريبي الذي تم تعيين خمسة فئران مانحة و 10 فئران متلقية لكل مجموعة.

بالنسبة للمجموعتين A و B ، سيتم زرع نخاع العظام من الفئران البرية إلى الفئران بالضربة القاضية. سيتم إحداث التهاب القولون في المجموعة A ، ولكن ليس المجموعة B.بالنسبة للمجموعة C و D.سيتم زرع نخاع العظام من الفئران بالضربة القاضية إلى النوع البري وسيتم إحداث التهاب القولون في المجموعة C فقط ل E و F. ستكون عملية الزرع من النوع البري إلى النوع البري وللمجموعتين G و H ، ستكون عملية الزرع من الضربة القاضية إلى الضربة القاضية. لتحضير نخاع عظم المتبرع لنقله إلى الفئران المشععة ، ابدأ باستخراج نخاع العظم من عظام الفئران المضحية في خزانة السلامة البيولوجية.

استخدم أدوات تشريح معقمة لكشف عظم العضد وعظم الفخذ والساق وعظام الشظية الخالية من الالتصاق العضلات والأربطة ونقلها إلى طبق بتري. افتح طرفي العظام لإظهار نخاع العظم الأحمر. ثم الإمساك بإحدى العظام بالملقط.

اغسل نخاع العظم الأحمر باستخدام PBS البارد باستخدام حقنة بثلاثة مليلتر وإبر قياس 25 إلى طبق بتري آخر. ثم اغسل العظم من الطرف الآخر لإنتاج المزيد من خلايا نخاع العظم. كرر هذه العملية مع كل عظمة.

قم بتجميع نخاع العظام من النوع البري وضرب الفئران بشكل منفصل. استخدم حقنة سعة ستة ملليلتر بإبرة قياس 18 بوصة لكسر سدادات نخاع العظم الأحمر عن طريق الشفط والطرد المتكرر. ثم استخدم ماصة مصلية لنقل نخاع العظم الذي تم جمعه إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

بمجرد نقل نخاع العظم بالكامل ، قم بتدوير نخاع العظم لأسفل عند 740 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات عن طريق الدوامة لمدة خمس إلى 10 ثوان. إلى الحبيبات ، أضف خمسة ملليلتر من مخزن تحلل XRBC واحد لكل دوامة فأر متبرع مرة أخرى لمدة خمس ثوان واحتضنه لمدة ثلاث دقائق بالضبط في درجة حرارة الغرفة.

بعد ثلاث دقائق ، أضف 20 مل من PBS البارد إلى كل أنبوب واخلطه عن طريق الانعكاس لإيقاف التحلل. ثم صب المحتويات من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. اشطف الأنبوب الأصلي بخمسة ملليلتر من PBS وانقل المحلول إلى مصفاة الخلية.

الاستمرار في جمع التدفق من خلال الأنبوب المخروطي. ثم ارفع الحجم إلى 50 مل مع PBS واخلطها عن طريق الانعكاس. بعد ذلك ، حدد عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد ثلاثي اللون الأزرق باستخدام مقياس الخلوي الدموي.

بمجرد تحديد عدد الخلايا ، قم بتدوير خلايا نخاع العظم عند 913 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية بناء على إجمالي عدد الخلايا. يعلق Resus الحبيبات في PBS في واحد مرات 10 إلى الخلايا الثامنة لكل مليلتر.

خلايا نخاع العظم جاهزة الآن للنقل إلى الفئران المتلقية المشععة. تم تشعيع الفئران البرية المتلقية والضربة القاضية لهذه التجربة ب 1000 راد كما هو موضح في الوثيقة المصاحبة ، ويتم تربية الفئران وإيوائها في منشأة خالية من مسببات الأمراض بعد أربع إلى 24 ساعة من تسخين الفئران المتلقية على وسادة تدفئة تحت مصباح الاحترار لحقن نخاع العظام المتبرع. ضع الفأر المتلقي في مصفاة ، وامسح الذيل بنسبة 70٪ من الإيثانول لتعقيم موقع الحقن وتعزيز توسع الأوعية الموضعي لسهولة الحقن.

باستخدام حقنة الأنسولين بإبرة قياس 28 ونصف ، قم بحقن واحدة في 10 إلى الخلايا السابعة في واحد إلى 200 ميكرولتر في وريد الذيل لكل فأر بعد الحقن. ضع الفأر في قفص مع ما يصل إلى ثلاثة فئران أخرى محقونة خلال الأسابيع الأربعة الأولى بعد الحقن. الحفاظ على الفئران المتلقية المحقونة في أقفاص الأوتوكلاف بالماء الذي يحتوي على تقليم السلفا بالمضادات الحيوية.

يتيح ذلك الوقت للحيوانات لاستعادة المناعة وتغيير الأقفاص والمياه المعالجة بالمضادات الحيوية والطعام كل أربعة أيام للحفاظ على النظافة. بعد أربعة أسابيع من التشعيع وزرع نخاع العظم ، انتقل إلى الماء العادي بدون مضادات حيوية وحافظ على الفئران لمدة أسبوعين آخرين لاستعادة البكتيريا الطبيعية في الأمعاء. بعد ستة أسابيع من حقن نخاع العظم ، قم بقياس وزن الجسم الأولي للحث على التهاب القولون.

أعط الفئران في المجموعة التجريبية لالتهاب القولون 5٪ كبريتات ديكستران في مياه الشرب. بعد خمسة أيام ، قم بتجميع الدم المحيطي من أربعة فئران في أنابيب مطلية بالهيبارين بالمكنسة الكهربائية وضعها على الجليد. ثم في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر ، امزج 300 ميكرولتر من الدم مع 300 ميكرولتر من تلطيخ الخلايا ، وقم بتخزين الدم في خمسة أنابيب اختبار لقياس التدفق الخلوي تسمى واحدة إلى خمسة لكل منها 100 ميكرولتر على الجليد.

بعد التضحية بالفئران ، قم بقياس وزن الجسم مرة أخرى واحسب التغيير. تشريح أنسجة القولون وقم بتسريعها في الفورمالين لتلوين h و d. ثم احصل على خلايا نخاع العظم كما كان من قبل.

قسم نخاع العظم المعلق إلى خمسة أنابيب طرد مركزي دقيقة تسمى من واحد إلى خمسة لكل منها 100 ملليلتر. استعدادا للتحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي ، قم بإعداد خليط الأجسام المضادة لكل أنبوب في الظلام كما هو موضح في المستند المصاحب ، وستكون عينات الدم ونخاع العظام المسماة رقم واحد بمثابة عناصر تحكم ولن تكون ملطخة بعينات الدم ونخاع العظام. سيتم تلطيخ الرقم الثاني المسمى بالتحكم في النمط النظيري fitzy ، والتحكم في النمط المتماثل PE ومحلول حجب CD 16 slash 32.

تستخدم عناصر التحكم في النمط الإسوائي هذه لتأكيد خصوصية عينات ربط الأجسام المضادة الأولية. سيتم تلطيخ الرقم الثالث المسمى ب FZ CD 45.1 و CD 16 الشرطة المائلة 32. سيتم تلطيخ عينات محلول الحجب المسمى رقم أربعة بقرص مضغوط 45.2 وشرطة مائلة 32 على القرص المضغوط 16.

حل الحظر. يمكن أن يكشف وضع العلامات أحادية اللون عن وجود خلايا متبرعة أو متلقية في الدم أو نخاع العظام. من الواضح أن العينات المسماة رقم خمسة سيتم تلطيخها بالقرص المضغوط 45.1 و CD 45.2 و CD 16 الشرطة المائلة 32.

يظهر حظر الملصقات ذات اللون المزدوج هنا النسبة النسبية للخلايا المانحة والمتلقية في الدم أو نخاع العظام. أضف خمسة ميكرولترات من خليط الأجسام المضادة اثنين وخمسة إلى أنابيب العينة الخاصة بهما. ثم أضف ثلاثة ميكرولترات من خليط الأجسام المضادة ثلاثة وأربعة إلى أنابيب العينة الخاصة بهما.

احتضان جميع الأنابيب على الجليد لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف ملليلترين ، مخزن مؤقت تحلل XRBC واحد لكل أنبوب. ثم احتضان العينات لمدة 15 دقيقة أخرى على الجليد في الظلام.

قم بتدوير الخلايا عند 350 مرة G، خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات بمحلول تلطيخ خلية 500 ميكرولتر في الظلام. ثم دوامة لفترة وجيزة.

بعد ذلك ، قم بإجراء قياس التدفق الخلوي على عينات الدم ونخاع العظام المناعية. حدد FZ لتمثيل النوع الكبير CD 45.1 و PE لتمثيل القرص المضغوط 45.2 بالضربة القاضية. قم بتحليل نتائج قياس التدفق الخلوي باستخدام برنامج Flo Joe.

احسب نسبة ملاءمة E إلى PE أو PE لتناسب نسبة e لتحديد ما إذا كان النمط الجيني للمتبرع هو النمط الجيني السائد في الدم ونخاع العظام. تظهر هذه الصورة عينة من الصور h و e للقولون المصابة بأنسجة طبيعية والتهاب القولون DSS. يتم تسجيل صور الأنسجة بناء على تلف الأنسجة المخاطية وتسلل العدلات إلى الأنسجة المخاطية وتحت المخاطية.

وبالتالي ، تشير درجة الأنسجة الأعلى إلى التهاب القولون الأكثر حدة لاختبار ما إذا كان اللين يلعب دورا في الوقاية من التهاب القولون. تم تبادل نخاع العظام بين الفئران البرية والضربة القاضية كما هو موضح في هذا الفيديو. ثم تم تقييم علم الأنسجة وتسجيله كما هو موضح هنا.

زادت درجات الأنسجة بشكل كبير عندما تم إدخال نخاع عظم الفأر بالضربة القاضية في الفئران البرية المشععة. على العكس من ذلك ، انخفضت الدرجات بشكل كبير عندما تم إدخال نخاع العظم البري إلى الفئران بالضربة القاضية. تشير هذه البيانات إلى أن الخلايا المشتقة من نخاع العظام C الذاتية لها تأثيرات مضادة للالتهابات وتحسن التهاب القولون للتحقق من نجاح عملية الزرع في هذه الفئران.

كما تم إجراء قياس التدفق الخلوي على نخاع العظام والدم من الفئران بعد الزرع. بقع نخاع العظم من النوع البري بقوة ل Fitz CD 45.1 ولكن ليس pe ، CD 45.2 كما هو موضح هنا ، بقع نخاع العظم بالضربة القاضية بقوة ل PE ولكن ليس Fitz كما هو موضح هنا. ومع ذلك ، بعد الزرع ، تم تلطيخ كل من نخاع العظام والدم من الفئران البرية التي تلقت نخاع العظم بالضربة القاضية بقوة من أجل PE ولكن ليس فيتز ، مما يشير إلى أن المجموعة السائدة من الخلايا الملطخة كانت من المتبرع.

وبالمثل ، فإن نخاع العظام والدم من الفئران بالضربة القاضية التي تلقت نخاع العظام من النوع البري ملطخة بقوة من أجل فيتزي ولكن ليس PE مرة أخرى مما يؤكد أن المجموعات الملطخة السائدة كانت من أصل متبرع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على إجراء تجربة زرع نخاع العظم ويجب أن تكون قادرا على تعديل التهاب القولون عبر الخلايا المشتقة من نخاع العظم.