دراسة التحلل البروتيني B من السيكلين على مستوى خلية واحدة في الجامعة السكان الخلية

تهدف هذه العملية إلى مراقبة كيف يتحكم التحلل البروتيني لـ cycling B في بدء طور الصعود (anaphase) والخروج من الانقسام الميتوزي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة خلايا cycling B snap reporter على شرائح مجهرية. وتتمثل الخطوة الثانية في وسم جزيء Cyclin B snap reporter الخيمري باستخدام الركيزة الفلورية TMR star.

بعد ذلك، يتم الحصول على سلسلة الصور في محطة مجهرية. تتمثل الخطوة النهائية في تحليل الخلايا وحساب شدة فلورة TMR star بمرور الوقت، وهو ما يعكس تحلل البروتين cycling B. وفي النهاية، يكشف المجهر الفلوري المناعي للخلايا المراسلة الحية عن حركية تحلل البروتين cycling B الذي يحدث أثناء الانقسام الفتيلي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل مراقبة cyclone BGFP، في أن cyclone B SNAP تتيح مراقبة تحلل cyclone B بدلاً من مراقبة تعبير البروتين بالكامل. يتم في البداية السماح لخلايا snap reporter المستخدمة في هذه التجربة بالنمو بشكل غير متزامن في طور النمو اللوغاريتمي لمدة 48 ساعة على الأقل. للبدء، يتم اتباع إجراء معاملة التريبسين لخلايا snap reporter التي لم تصل بعد إلى حالة التلاقي الكامل، وذلك من أجل استزراع الخلايا في غرف مجهرية مكونة من ثماني آبار مع ضمان توزيع ثابت عبر السطح الكامل لجهاز الطرد المركزي في الغرفة.

يتم تعليق 10,000 خلية وResus في 350 µL من وسط نمو طبيعي خالٍ من الفينول الأحمر. يتم نقل معلق الخلايا إلى حجرة المجهر لزراعة الخلايا في حجرات مجهرية مكونة من ثماني آبار مع ضمان وصول أعلى كثافة خلوية في مركز الحجرة. أولاً، يتم ملء الحجرة بـ 300 µL من وسط نمو طبيعي خالٍ من الفينول الأحمر.

بعد ذلك، أضف 5,000 خلية بعناية إلى مركز غرفة المجهر لزراعة الخلايا على ألواح بصرية خاصة ذات 96 بئراً بتوزيع ثابت عبر السطح الكامل للبئر، ثم قم بطرد 5,000 خلية مركزياً وأعد تعليقها في 300 µL من وسط نمو طبيعي خالٍ من الفينول الأحمر بناءً على العدد الإجمالي للآبار التي تحتوي على خلايا والمطلوبة. قم بتعديل عدد الخلايا والحجم الإجمالي لوسط التعليق.

بعد ذلك، يتم نقل معلق الخلايا إلى طبق يحتوي على 96 بئراً لزراعة الخلايا في أطباق بصرية خاصة مكونة من 96 بئراً، مع ضمان وجود أقصى كثافة للخلايا في مركز البئر. أضف بعناية 1,500 خلية في 15 µL من وسط نمو طبيعي خالٍ من الفينول الأحمر على شكل قطرة صغيرة في مركز كل بئر.

سيؤدي ذلك إلى حصر نمو الخلايا في مركز البئر. اترك جميع الخلايا المستزرعة لتنمو لمدة 18 ساعة على الأقل في ظروف استزراع الخلايا القياسية قبل 30 دقيقة من بدء إجراء الصبغ. قم بتدفئة كميات من وسط النمو الطبيعي الخالي من الفينول الأحمر إلى 37 درجة مئوية.

ركيزة الـ snap المستخدمة في هذا العرض التوضيحي هي TMR star لسهولة التعامل؛ قم بإذابة TMR star في DMSO للحصول على محلول مخزون بتركيز 400 micromolar، ثم خفف 0.5 microliters من المحلول المخزون لـ TMR star في 200 microliters من وسط نمو طبيعي دافئ وخالٍ من phenol red للحصول على تركيز وسم نهائي قدره one micromolar. بعد ذلك، قم بإزالة وسط النمو الطبيعي من الخلايا التي تنمو بشكل غير متزامن واستبدله بوسط الوسم، ثم حضن الخلايا في وسط الوسم لمدة 25 دقيقة تحت ظروف الزرع القياسية.

بعد مرور 25 دقيقة، قم بإزالة وسط الوسم واغسل الخلايا أربع مرات باستخدام وسط نمو عادي دافئ وخالٍ من الفينول الأحمر. بعد الغسلة الأخيرة، قم بتحضين الخلايا في 300 µL من وسط نمو عادي دافئ وخالٍ من الفينول الأحمر لمدة 30 دقيقة قبل نقلها إلى المجهر. استبدل الوسط بوسط نمو عادي دافئ وطازج وخالٍ من الفينول الأحمر لإزالة ركيزة snaps غير المرتبطة المتبقية، ثم انقل الخلايا إلى المجهر في صندوق من البوليسترين فوق كتلة تسخين مسبقة التدفئة عند 37 °C.

لتقليل تباين درجات الحرارة قبل ساعتين من قياس شدة الفلورية، يتم ضبط درجة حرارة الهواء في غرفة المناخ على 37 درجة مئوية في الوضع الجاف، وذلك لإيصال المجهر وجميع مكوناته إلى درجة الحرارة المطلوبة. ولتجنب التكثيف وما يليه من تلف للمجهر، من المهم القيام بالتسخين المسبق قبل ضبط الرطوبة.

عندما يصل نظام المجهر بأكمله إلى 37 °C، اضبط رطوبة الهواء على 60% وثاني أكسيد الكربون على 5%. قم بتشغيل برنامج المسح أو الحصول على البيانات وحدد الإعدادات القياسية. حدد مواقع الآبار المراد تحليلها. حدد قيمة delta T أو زمن دورة الحصول على البيانات والعدد المطلق لدورات الحصول على البيانات.

في هذا العرض التوضيحي، يتم اختيار التركيز التلقائي للأجهزة (Hardware autofocus) مسبقاً لتحليل عدد أكبر من الآبار. ابدأ عملية الاستحواذ وراقب أول دورتين من دورات الاستحواذ.

سوف يتم ضبط تركيز المجهر على إشارة GFP لبروتين الهيستون H2، مع التقاط صورة أولى في هذه القناة قبل تغيير المرشح والتقاط صورة TMR star المقابلة. وتتكرر هذه العملية لجميع المواضع داخل البئر الواحد ولكل بئر من الآبار المراد فحصها قبل تكرار الدورة التالية مرة أخرى. ولتحليل ملفات التحلل البروتيني، قم بتشغيل برنامج تحليل Scan R.

قم بتحليل الصور التي تظهر فيها نويات الخلايا كما تم تصويرها بواسطة histone H two GFP، والتي تُحدد كجسم رئيسي باستخدام عتبة تعتمد على شدة الإشارة وخوارزمية watershed للمساعدة في فصل الخلايا المتجاورة. يجب إنشاء جسم فرعي يتكون من النواة مع السيتوبلازم لإجراء تحليل TMR star. تشمل الخصائص المهمة للجسم الرئيسي مواضع X و Y، والزمن، والشدة القصوى ومتوسط شدة GFP للجسم الرئيسي، بالإضافة إلى الشدة الكلية مقسومة على المساحة.

بالنسبة للكائن الفرعي TMR star، قم بالتغيير إلى وضع التتبع (trace mode) لتصور متوسط شدة فلورة TMR star للكائن الفرعي بمرور الوقت، أو تتبعات الخلايا المخصصة للكائنات الرئيسية التي تم تحليلها. تتيح دراسة أعداد أكبر من الخلايا رؤية تمثيلية وموضوعية أولية، ولكن يمكن تقليص عدد الخلايا التي سيتم فحصها من خلال تحديد القياسات التي تستمر لمدة 140 دورة على الأقل وتحتوي على شدة قصوى عالية لـ histone H two GFP. اختر تتبع خلية محل اهتمام لتصور فلورة histone H two GFP و TMR star بشكل متزامن على مستوى الخلية الواحدة.

باستخدام الزر الأيمن للفأرة، انقر فوق الخلية المستهدفة لإنشاء صورة قابلة للتصدير. معرض لتوضيح histone H2 GFP و cycling B snap TMR star لكل نقطة زمنية. قم بتغيير وضع برنامج تحليل الماسح الضوئي إلى وضع السكان (population mode) وحدد المنطقة التي تظهر فيها الخلية المستهدفة في مخطط النقاط (dot blot).

قم بتطبيق نافذة مخطط نقطي (dot plot) جديدة على المنطقة المحددة (gated region) وقم بتصور متوسط كثافة فلورة TMR star بمرور الوقت. قم بتصدير البيانات إلى برنامج Microsoft Excel لإجراء مزيد من الحسابات. توضح الأشكال هنا حركية Cyclin B المتمثلة في منحنى كثافة فلورة TMR star لخلية تمر بعملية انقسام ميتوزي منتظمة دون ظهور علامات على عدم محاذاة الكروموسومات عند تكثف السيتوبلازم عقب تفكك الغلاف النووي أو NEBD كما يشير المثلث الأحمر؛ حيث تظهر كثافة فلورة TMR staph زيادة مفاجئة حتى الوصول إلى النافذة متماثلة الشكل (isomorphic window).

عندما تدخل الخلية طور前مقدمة الاستواء (prometaphase)، تظل شدة التألق عند مستوى مستقر طوال فترة مرور الخلية عبر طور前الاستعداد (prophase) وطور الاستواء (metaphase)، ثم تبدأ في الانخفاض سريعاً. وبمجرد أن تشكل جميع الكروموسومات صفيحة استواء مستقرة، يسبق هذا الانخفاض عملية انفصال الكروموسومات. وخلال طور الانفصال (anaphase) المشار إليه بالنقطة الزرقاء على المنحنى في مرحلة متأخرة من الانقسام الفتيلي، يبدأ الكروماتين في فك التكاثف وتتخذ الخلية مورفولوجيا طور الانفصال.

بينما يقترب منحنى شدة الفلورية من مرحلة الثبات، والتي تكون أقل من مرحلة الثبات التي تسبق الانقسام الفتيلي بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الانقسام الفتيلي لاستكشاف التوازن الدقيق بين التدوير والتحلل والاصطناع الذي ينظم التقدم في عملية الانقسام الفتيلي.