طريقة عملية ومبتكرة لاستخراج الحمض النووي الجينوم من الدم أطقم مجموعة لحفظ البلازما بروتين

سيصف هذا الفيديو طريقة عملية ومبتكرة لاستخلاص الحمض النووي الجينومي (genomic DNA) من نظام BDP 100 الجديد للحفاظ على بروتينات البلازما، والمعروف بأنابيب P 100. لقد كان الاستخلاص من أنابيب مصل الدم والبلازما إجراءً شائعاً جداً في الماضي، ولكن الجمع بين أنبوب P 100 الجديد وطريقة الاستخلاص المعروضة هنا يوفر نهجاً مبتكراً وأسهل لاستعادة حمض نووي بجودة أفضل وبجهد أقل بكثير. يتم طلاء الجزء الداخلي من أنبوب P 100 بمادة potassium EDTA ومثبطات البروتياز (protease inhibitors).

يمنع هذا التجلط ويعمل على استقرار بروتينات البلازما. يتم جمع الدم في هذه الأنابيب بغرض استعادة البلازما لاختبارها بعد عملية الطرد المركزي. ينفصل الدم الموجود في أنبوب P 100 إلى طبقات بناءً على الكثافة، حيث تكون البلازما في الأعلى، وكريات الدم الحمراء في الأسفل، وكريات الدم البيضاء.

الطبقة البيضاء (Buffy coat) تقع بين هاتين الطبقتين. وعادة ما يكون الغرض الأساسي من هذه الأنابيب هو استخلاص البلازما. وتُجرى عدة قياسات باستخدام هذه البلازما، مثل قياس مستويات الأجسام المضادة والبروتينات.

عادةً ما يتم التخلص من الطبقة الفيبرينية (buffy coat)، ولكن كما سيوضح هذا الفيديو، فإنها تحتوي على كمية كافية من DNA لإجراء عدة تحليلات بما في ذلك التسلسل، والتنميط الجيني، وتحديد المؤشرات الحيوية، وغيرها. تتكون أنابيب P one hundreds من ثلاثة مكونات رئيسية: غطاء الأنبوب، والأنبوب، والفاصل. يتحرك الفاصل الميكانيكي إلى موقع أعلى طبقة الفيبرين مباشرةً.

للوصول إلى الطبقة البيضاء (buffy coat)، من الضروري زيادة المسافة بين الفاصل والطبقة البيضاء. ويتم تحقيق ذلك بإضافة 17% sucrose. عادةً ما يتم التخلص من الطبقة البيضاء مع أنابيب P 102، ولكن كما سيظهر في هذا الفيديو، فمن الممكن استعادة كمية كافية من DNA من هذه الطبقة بسهولة لإجراء عدة اختبارات تحليلية قبل استعادة أنابيب P 100 من مجمد درجة حرارة 80- درجة مئوية.

قم بتسخين حمام مائي مسبقاً إلى 37 °C، ثم ضع كل أنبوب P 100 في الحمام المائي الساخن واتركه لمدة خمس دقائق تقريباً لإذابة جميع العينات. وبمجرد ذوبان جميع العينات تماماً، يجب إزالة أي مصل متبقٍ فوق الفاصل. بعد ذلك، يتم إضافة 5 mL من السكروز بتركيز 17% فوق الفاصل. وبعد إضافة السكروز، يتم طرد مركزي لجميع الأنابيب لمدة 20 دقيقة عند 2,500 G. والآن، بعد أن أصبح الفاصل في الجزء العلوي من الأنبوب وتحرر من الطبقة البيضاء (buffy coat)، يمكن إزالته بسهولة.

يُرش إيثانول 70% على ممسحة كيميائية، ثم تُعقم خطافة مشبك الورق عن طريق مسح السطح بالكامل بدقة. تُمسك أنبوبة P 100 بزاوية 45 درجة مع مشبك الورق المعقم. يبدأ إخراج الفاصل من الأنبوبة عن طريق سحب حافة الفاصل برفق وتوجيهه إلى كيس النفايات البيولوجية الخطرة.

بعد إزالة الفاصل، اسحب أكبر قدر ممكن من طبقة السكروز 17% دون تعكير طبقة الغشاء الأبيض (buffy coat) أو طبقات خلايا الدم الحمراء، بحيث تصبح طبقة الغشاء الأبيض الآن هي الطبقة العلوية في الأنبوب. انقل هذه الطبقة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter جديد ومسمى. سيختلف حجم الغشاء الأبيض المستخرج من كل أنبوب، ولكن يجب أن يكون أقل من ثلاثة milliliters.

لتوحيد حجم جميع الأنابيب، أضف كمية كافية من PBS (المحلول الملحي الموقوف بالفوسفات) ليصل حجم كل أنبوب إلى 3 mL. وبما أن جميع الطبقات البيضاء (buffy coats) أصبحت معلقة في حجم متساوٍ، يجب الآن إزالة أي خلايا دم حمراء متبقية عن طريق إضافة 9 mL من محلول تحلل RBC (خلايا الدم الحمراء).

بعد ذلك، اقلب الأنابيب عدة مرات خلال فترة تحضين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لفصل خلايا الدم الحمراء المتحللة عن الطبقة المياسيه (Buffy coat). قم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 2,500 G، حيث يؤدي الطرد المركزي إلى تكوين كريّة يُستخلص منها الـ DNA. اسكب هذه النفايات من كل أنبوب في وعاء مخصص للمخلفات البيولوجية السائلة، مع ترك حجم صغير لإعادة تعليق الكريّة فيه. استخدم جهاز الرج (Vortex) للأنبوب لفصل الكريّة وإعادة تعليقها.

أضف 3 mL من محلول تحلل الخلايا وقم بالرج العنيف باستخدام جهاز vortex لمدة 10 ثوانٍ على الأقل. بعد تحلل الخلايا، تصبح البروتينات والحمض النووي (DNA) معلقة بحرية داخل المحلول ويجب فصلها؛ ابدأ بترسيب البروتينات باستخدام 1 mL من محلول ترسيب البروتين، والرج العنيف باستخدام جهاز vortex على سرعة عالية لمدة 15 ثانية على الأقل. الآن، قم بطرد الأنابيب مركزياً لمدة خمس دقائق عند 2,500 G لترسيب البروتينات في قاع الأنبوب أثناء عملية الطرد المركزي هذه.

اتبع الخطوات بدقة. ضع ملصقاً على أنبوب مخروطي سعة 15 مل لكل عينة يتم نقلها إلى الأنابيب الجديدة. انقل 3 مل من الإيزوبروبانول بتركيز 100%.

بمجرد ترسيب البروتينات وطردها مركزياً، يجب أن تحتوي كل أنبوبة على ركازة كبيرة نسبياً وطافٍ شفاف في معظمه؛ صب الطافٍ المحتوي على DNA من كل أنبوبة في أنبوبة الإيزوبروبانول المقابلة التي تم تحضيرها أثناء عملية الطرد المركزي الأخيرة، حيث سيؤدي الإيزوبروبانول إلى ترسيب DNA الموجود في المحلول على شكل خيوط بيضاء صغيرة وهشة. اقلب جميع الأنابيب 50 مرة لضمان الخلط الجيد، ثم قم بطرد جميع الأنابيب مركزياً لمدة ثلاث دقائق عند 2,500 G لتكوين ركازة DNA. عادة ما يكون DNA مرئياً كركازة بيضاء صغيرة في قاع الأنبوبة، ومع ذلك، قد تكون حصيلة DNA المنخفضة غير مرئية بالعين المجردة. استمر في جميع عمليات الاستخلاص حتى يتم قياس التركيزات.

بغض النظر عن وجود كتلة DNA المترسبة، تخلص من محلول الإيزوبروبانول. اغسل الـ DNA بإضافة ethanol بتركيز 70%. ستعمل هذه الخطوة على إزالة أي مكونات غير مرغوب فيها متبقية قد تتداخل مع التحاليل اللاحقة، ثم قم بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 2,500 G. ولضمان التصاق كتلة DNA جيداً بقاع الأنبوب، تخلص من جميع الـ ethanol بتركيز 70% من الأنابيب، ثم اقلبها على منشفة ورقية نظيفة لتجف في الهواء لمدة ساعة واحدة.

يجب ألا يتبقى أي إيثانول مرئي في الأنابيب عند مواصلة البروتوكول. وتتمثل الخطوة النهائية في عملية الاستخلاص في إعادة تعليق الـ DNA في محلول، حيث يعد محلول ترطيب الـ DNA أو الماء خيارات مناسبة لمعظم عمليات الاستخلاص.

أضف كمية أقل من محلول ترطيب DNA، بمقدار 250 microliters، للعينات التي تنتج خيوط DNA أو رواسب مرئية قليلة أو معدومة، ثم قم برج DNA بلطف وبشكل تدريجي باستخدام جهاز الـ vortex لتعليقه. وأخيرًا، انقل كل الـ DNA المعلق إلى أنبوب طرد مركزي. في هذه المرحلة، يمكن قياس تركيز ونقاء DNA باستخدام جهاز NanoDrop أو أي مقياس طيف ضوئي آخر.

بشكل عام، يُتوقع أن تكون نقاوة الـ DNA قريبة من نقاوة الـ DNA المستخلص مباشرة من الدم الكامل الذي تم الحصول عليه في أنابيب EDTA البوتاسيوم والمجمعة لغرض استعادة الـ DNA وحده، ويعتمد تركيز الـ DNA على كمية المادة البدئية، ولكن يمكن أن يتراوح من 50 nanograms per microliter إلى ما يقرب من 1000 nanograms per microliter، بمتوسط في نطاق 200 nanograms per microliter. وتتمثل فائدة استخدام هذا البروتوكول في جانبين؛ أولاً، فهو يتيح للأطباء استخدام سحبة دم واحدة لإجراء اختبارين سريريين بدلاً من سحب الدم مرتين.

ثانيًا، فهي تبسط عملية الوصول إلى الخلايا التي تحتوي على DNA من خلال استخدام أنابيب الفصل الميكانيكية الحديثة بدلاً من الأجيال السابقة. ففي أنابيب الفصل الهلامية من الجيل السابق، كان كل من الفصل الهلامي نفسه وتجلط الدم يعملان كحواجز تمنع الوصول إلى الخلايا التي تحتوي على DNA. أما في أنابيب P 100، فيمكن إزالة الفاصل الميكانيكي بسهولة باستخدام الفصل بالكثافة بواسطة 17%Sucrose.

هذه لقطة شاشة لقراءة جهاز nano drop لعملية استخلاص DNA متوسطة. باستخدام هذه الطريقة لكل عينة P 109، نتج عن الاستخلاص محلول بحجم 250 µL وبتركيز 209 ng/µL من DNA. وكان إجمالي الحصيلة حوالي 52 µg.

وقعت نسبة 260/280، وهي المقياس الأساسي لنقاء DNA، ضمن النطاق الأمثل من 1.8 إلى 1.9 حيث بلغت 1.88. أما المقياس الثانوي لنقاء DNA، وهي نسبة 260/230، فقد كانت قريبة من النطاق المتوقع من 2 إلى 2.2 حيث بلغت 2.35.

تعتبر هذه النتائج نموذجية إلى حد كبير. ومن الناحية الواقعية، ستتفاوت عمليات الاستخلاص من حيث الإنتاجية والجودة، وذلك اعتماداً على حجم الدم وحالته قبل الاستخلاص باستخدام الفصل الكهربائي الهلامي القياسي مع صبغة thio bromide. وتظهر اختبارات الجودة الإضافية أن DNA الجينومي المستخلص من أنابيب P 100 سليم تماماً مثل DNA المستخلص من الدم الكامل.

يتضح ذلك من الحزمة السميكة والساطعة التي تظهر في الجزء العلوي من كل مسار يحتوي على DNA جينومي. هناك فائدتان رئيسيتان لاستخدام هذا البروتوكول بدلاً من الطرق السابقة؛ أولاً، فهو يدمج ما كان يتطلب عادةً سحب عينتين من الدم في عملية سحب واحدة.

ثانياً، يُعد هذا البروتوكول أسرع وأكثر دقة من البروتوكول الذي يتضمن استخدام أنابيب فصل الهلام SST التقليدية؛ فمن خلال إزالة الحاجة إلى تفكيك تخثر الدم بشكل روتيني، يسحب السريريون أنبوبي دم عند الحاجة إلى إجراء الاختبارات الجينية والمصلية. وبشكل عام، يتم سحب أنبوب فصل هلام SST يُسمى "الغطاء الذهبي" وأنبوب بوتاسيوم EDTA يُسمى "الغطاء الأرجواني"، حيث يُزال المصل من أنبوب SST ويُستخلص DNA من أنبوب الغطاء الأرجواني. أما استخدام هذه الطريقة فيكون ضرورياً فقط لسحب أنبوب P 100 واحد ذو غطاء أحمر.

بينما قد تكون المؤسسات المعتادة على طريقة فاصل الهلام لاستخلاص DNA تقوم بالفعل بسحب أنبوب واحد لكل من الاختبارات المصلية والجينية، فإن الطريقة المقدمة هنا تمثل تحسيناً تدريجياً ولكن جوهرياً مقارنة بطرق فاصل الهلام الحالية. تتطلب كلتا الطريقتين إزالة نوع من الفواصل، على الرغم من أن الهلام يميل إلى أن يكون أكثر إحداثاً للفوضى من الهلام البلاستيكي.

تتطلب أنابيب الفصل تجانس الدم المتجلط عبر شبكة سلكية قبل استخلاص DNA. ويمكن أن تكون عملية التجانس هذه مربكة، كما يثبت أن استخلاص DNA يكون أكثر صعوبة عند وجود خلايا الدم الحمراء، التي لا تحتوي على DNA، بكمية ملحوظة. تسمح طريقة استخلاص P 100 هذه بفصل خلايا الدم البيضاء التي تحتوي على DNA عن المكونات الخلوية للدم (hematocrit)، مما يترك القليل من خلايا الدم الحمراء التي قد تتداخل مع عملية استخلاص DNA.

يتمتع نظام استعادة DNA من أنبوب بلازما P 100 بدلاً من أنابيب فصل الهلام من الجيل السابق بالعديد من المزايا. تحتوي أنابيب P 100 على EDTA، الذي يثبط إنزيم endonuclease المعتمد على المغنيسيوم، بالإضافة إلى مضاد للتخثر لمنع تجلط الدم. والنتيجة النهائية هي الحصول على سلامة أعلى لـ DNA من خلال بروتوكول استخلاص أسهل بكثير، وبالتحديد تجنب عملية تفتيت وتجانس الدم المتجلط.

بالإضافة إلى ذلك، يمكن تخزين الدم المنزوع البلازما في أنابيب P100 لفترة غير محددة تصل إلى ثلاث سنوات حتى يحين وقت استخلاص DNA. علاوة على ذلك، سيتمكن السريريون من الحصول على بيانات أكثر فائدة للمرضى من خلال عدد أقل من عمليات سحب الدم، وبالتالي تقليل الضغط النفسي والجسدي على المرضى الذين يخضعون للإجراءات.