مقايسة لتقييم سلوك يزدرع الخلوية من اللحمة المتوسطة القحف

الهدف من هذا الإجراء هو مراقبة سلوك مستنبتات الخلايا الجذعية العصبية القحفية تحت ظروف استنبات محددة. وتتمثل الخطوة الأولى في جمع القرون الرحمية من فأرة حامل في وقت محدد.

بعد 8.5 أيام من التزاوج. بمجرد عزلها، يتم إخراج الأجنة من الساقط (decidua) وإزالة كيس المح، وذلك لإجراء التنميط الجيني. بعد ذلك، يتم استئصال المناطق القحفية مجهرياً ونقلها إلى أطباق زراعة أنسجة مغلفة بالمصفوفة خارج الخلية.

يُترك لـ X من المستأصلات (explants) لكي تلتصق، ثم تُستزرع لمدة تصل إلى 48 ساعة في وجود أو غياب عوامل فارماكولوجية محددة. وفي النهاية، يتم التقاط صور للمستأصلات لإظهار الاختلافات في هجرة الخلايا. وتعد هذه الطريقة مفيدة للإجابة على أسئلة جوهرية، مثل ما هي مسارات التأشير وبروتينات المصفوفة خارج الخلوية المشاركة والتي تتحكم في سلوك الـ cran باستخدام kind أثناء ارتفاع الطيات العصبية (neuro fold elevation).

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرًا بالغ الأهمية لأن خطوات التشريح الدقيق يصعب تعلمها وتتطلب الصبر والممارسة لإتقانها. للبدء، إذا كان سيتم إجراء الكيمياء النسيجية المناعية، قم بتجهيز شرائح التغطية، وإلا، تخطَّ هذه الخطوة وقم بطلاء أطباق زراعة الأنسجة مباشرة بـ ECM. يتم تعقيم شرائح التغطية الزجاجية الدائرية بقطر 12 مليمتر عن طريق غمرها في الإيثانول، ثم تُترك لتجف في الهواء. بعد ذلك، ضع شريحة تغطية معقمة في كل بئر من أطباق الـ 12 بئر.

داخل غطاء التدفق الصفائحي (laminar hood)، يتم وضع 1 mL من المصفوفة خارج الخلوية (extracellular matrix) أو ECM لتغطية الشرائح الزجاجية أو قاع طبق زراعة الأنسجة. تُحضن الأطباق عند 37 °C لمدة ثلاث ساعات، وبعد فترة التحضين، يتم سحب محلول ECM وشطف الأطباق ثلاث مرات باستخدام PBS. في هذه المرحلة، يمكن استخدام الأطباق المطلية على الفور أو تغليفها وتخزينها عند 4 °C لمدة تصل إلى أسبوعين.

المساعدة في تصوير الجنين الشفاف. يتم تحضير ألواح Syl guard ذات خلفيات سوداء مقاومة، وذلك باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.

قم بتجهيز أدوات التشريح عن طريق إدخال دبوس دقيق في حامل الدبابيس. استخدم حجر شحذ لشحذ الملاقط بمجرد تجهيز كل شيء. اجمع الرحم من فأرة حامل في توقيت محدد، بعد 8.5 days من عملية الـ quot.

ضع الرحم المعزول في طبق يحتوي على PBS معقم وقم بغسله. بمجرد وضعه تحت مجهر التشريح، افصل كل جزء من الساقط (decidua) على حدة باستخدام المقص مع الملاقط. قم بإزالة الأنسجة الضامة الرحمية عن طريق التمزق، مع الحرص على عدم تسليط ضغط قد يؤدي إلى خروج الجنين من الساقط.

استخدم الملقط لتمزيق أنسجة الرحم بعناية من الجانب المقابل للمشيمة. ومن أجل كشف الجنين المحاط بكيس المح، استخدم الملقط لقرص الجنين وكيس المح وفصلهما عن المشيمة، ثم أزل أنسجة الرحم من الطبق. بعد ذلك، وباستخدام الملقط للتمزيق برفق، قم بإزالة كيس المح من الجنين.

ضع كيس المحّ في أنبوب إبندورف لإجراء التنميط الجيني باستخدام ماصة، وبمجرد عزله، حدد مرحلة الجنين عن طريق عد القطعات الجسدية. ومن الناحية المثالية، سيكون الجنين بين المرحلة السادسة والعاشرة، أي في مراحل محتملة. وفي هذه المرحلة، تبدأ الطيات العصبية للتو في الارتفاع، ولم يحدث بعد التشكل الرئيسي للمتوسط الجنيني القحفي.

بمجرد تحديد المرحلة، انقل الجنين إلى لوحة حماية خلوية سوداء تحتوي على DMEM خالية من الفينول الأحمر. أولاً، وباستخدام مجهر تشريحي بأعلى تكبير ممكن، ركز على رأس الجنين مع إمساك إبرة تشريح في كل يد، ثم قم بتشريح الرأس أمام منطقة rmba. بعد ذلك، اقطع على طول الخط المتوسط لتقسيمه إلى نصفين.

قم بتشريح الرأس إلى نصفين متساويين باستخدام إبرة تشريح في كل يد. قم بتشريح الحواف الخارجية على طول هامش رأس الجنين والخط المنصف. قم بإزالة الأنسجة الزائدة عند الحاجة لمنع الخلط بين الجزء المطلوب والأنسجة غير المرغوب فيها.

سوف يحتوي المستنبت على العرف العصبي القحفي المهاجر، والميزوديرم الموازي، والاكتوديرم السطحي لإزالة الخلايا المرتبطة بشكل فضفاض. قم بسحب السائل ودفعه بعناية باستخدام طرف ماصة سعة 200 µL. وبالنسبة للمستنبت، قم بالتقاطه بعناية باستخدام طرف الماصة.

في حوالي 10 µL من وسط DMEM، ضَع في مركز بئر مغطاة لزراعة الأنسجة 20 µL من وسط DMEM الدافئ المكمل بنسبة 15% FBS، ويمكن الآن نقل طبق الزرع إلى حاضنة زراعة الأنسجة. بعد مرور ساعة إلى ساعتين تقريبًا، تلتصق العينة المفسرة (explan) ويمكن إضافة 250 µL إضافية من الوسط الغذائي. بعد مرور 24 ساعة تقريبًا، ستكون العينة المفسرة ملتصقة بقوة بغطاء الشريحة.

في هذا الوقت، يمكن إضافة العوامل الدوائية إلى الأوساط بعد مرور 24 ساعة إضافية، حيث ستهاجر الخلايا من هذه. وعادةً ما يتم التقاط الصور لتوثيق المسافة وعدد الخلايا التي تهاجر من هذه. وفي هذه المرحلة، تبدأ في إظهار علامات انخفاض الحيوية مع ملاحظة ذلك في عمليات التحضين الأطول.

فيما يلي أمثلة على الخلايا المهاجرة من النباتات القحفية والذقنية. بعد مرور 48 ساعة في ركائز مختلفة، يعتمد كل من شكل وحجم الخلايا المهاجرة من المستأصل على نوع الركيزة. وقد تم دعم الهجرة على الفبرونيكتين، واللامينين، وماكس جيل، والمادة الخلالية (ECM)، وحمض الهيالورونيك.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل التألق المناعي والتصوير الحي لمزيد من استقصاء المسارات التي تنظم سلوك الـ cranial me inkin أثناء ارتفاع الطية العصبية.