نماذج من الانبثاث العظام

الهدف العام من هذا الإجراء هو حقن الخلايا الورمية بطريقة تؤدي إلى تحفيز نمو الخلايا الورمية في العظام وما يلي ذلك من تدمير للعظم. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إعادة تعليق الخلايا الورمية في PBS بارد ووضعها على الثلج. بعد ذلك، يتم حقن عدد مناسب من الخلايا في البطين الأيسر للقلب أو في عظمة الظنبوب لفأر مخدّر.

بعد ذلك، يتم رصد نمو الورم العظمي ومعلمات العظام بشكل طولي عبر تقنيات تصوير متعددة. وفي الختام، يتم إجراء القياس الكمي النهائي لمعلمات الورم والعظام. وفي نهاية المطاف، يُستخدم مزيج من التصوير الفلوري أو التألقي الحيوي في الجسم الحي وخارجه، بالإضافة إلى التصوير الشعاعي ثنائي الأبعاد والتصوير ثلاثي الأبعاد.

يُستخدم التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (Micro CT) وعلم الأنسجة لإظهار نمو الورم والتغيرات في البيئة المجهرية للعظام على المستويين الخلوي والتركيبي للنمو. ويمكن لهذه الطرق أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال نقائل السرطان، مثل العوامل الموجودة في العظام التي تسمح بالاستعمار النقائلي لسرطاني الثدي والبروستاتا. ستقوم Alisa Merkel، وهي مساعد باحث في مختبري، بتوضيح كيفية تحضير الخلايا، مع الحفاظ على الخلايا لمدة تقل عن أسبوع واحد.

يتم تحضين مستنسخ MDAMB231 الملحق بـ GFP في وسط DMEM يحتوي على 10% FBS و0.1 mg/mL من البنسلين والستربتومايسين عند درجة حرارة 37 °C وفي بيئة تحتوي على 5 إلى 8% CO2. عند وصول الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 80 و90%، يتم استبدال الوسط بنسبة تخفيف 1:10. ولتجهيز الخلايا للتلقيح، يتم معالجتها بـ 0.15% trypsin EDTA باستخدام 10 mL عند وصولها إلى درجة تلاقي تتراوح بين 80 و90%.

باستخدام وسط DMEM مبرد بالثلج مع 10% FBS، انقل الخلايا فوراً إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملiliter وقم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الراسب في أنبوب مخروطي سعة 50 ملiliter في 25 ملiliter من محلول PBS مبرد بالثلج وخالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم، ثم قم بعدّ الخلايا، وأعد تعليق الخلايا في محلول PBS مبرد بالثلج بتركيز 10^6 خلايا لكل ملiliter للتلقيح داخل القلب، و250,000 خلايا لكل ملiliter للحقن داخل الظنبوب.

تُستخدم في هذه التجارب إناث الفئران ضعيفة المناعة التي تتراوح أعمارها بين أربعة إلى ستة أسابيع، والتي تم تغذيتها بنظام غذائي Tela 29 20 x قبل خمسة إلى 10 أيام من الحقن. بعد تخدير الفأر في غرفة باستخدام 2.5%isof fluorine، يتم نقل الفأر تحت غطاء تهوية إلى مخروط أنفي ووضعه على ظهره. يُستخدم محلول 10%povidone iodine لغسل منطقة الصدر، يليه 70%Ethanol.

حدد موقع الحقن في صدر الفأر في منتصف المسافة بين الثلمة القصية وأعلى الناتئ الخنجري وإلى اليسار قليلاً من عظمة القص. بعد ذلك، وباستخدام حقنة إنسولين مقاس 28gauge وبسعة 300 µL وطول نصف بوصة، اسحب فقاعة صغيرة من الهواء لخلق مسافة بين المكبس والسطح الهلالي، ثم اسحب 100 µL من الخلايا أثناء شد جلد الفأر بإحدى اليدين.

أبقِ الإبرة في وضع عمودي، ويجب أن يؤدي الإدخال الناجح في البطين القلبي الأيسر إلى ظهور نبضة واضحة من الدم الأحمر الزاهي في المحقنة. عند هذا العمق، اضغط بحذر على مكبس المحقنة دون تحريك الإبرة بشكل ملحوظ لتجنب ثقب القلب أو تسرب الخلايا إلى تجويف الصدر. وللتقليل من تنقيط الخلايا في تجويف الصدر، اسحب المكبس قليلاً لإنشاء قدر بسيط من الضغط السلبي.

بعد ذلك، اسحب الإبرة مباشرة من الصدر مع الحرص على تجنب إمالتها أثناء الإزالة، لأن ذلك قد يؤدي إلى تمزق غشاء القلب وتسبب النزيف. اضغط بلطف فوق موقع الحقن لتقليل النزيف لمدة دقيقة واحدة تقريبًا. وأثناء إزالة المخروط الأنفي، انقل الفأر إلى وسادة تدفئة حتى يستعيد وعيه بالكامل.

قبيل البدء مباشرة في الإجراء داخل الظنبوب، احقن الفأر بمادة bup printex. وبعد تخدير الفأر ووضعه في مخروط الأنف، قم بتنظيف الساقين باستخدام بوفيدون يود بتركيز 10%، يليه الإيثانول باستخدام أربعة أصابع وإبهام.

أمسك برفق بالكعب الوحشي والكعب الإنسي والنصف السفلي من عظمة الظنبوب. ثم اثنِ الساق بحيث تكون الركبة مرئية ويمكن الوصول إليها. باستخدام 70% ethanol، بلل الجلد لزيادة وضوح الرباط الرضفي الكامن تحته، والذي يجب أن يظهر كخط أبيض سميك ومميز أثناء الإمساك بالكاحل بإحكام.

أدخل إبرة مقاس 28 عيار بنصف بوصة تحت الرضفة عبر منتصف الرباط الرضفي وصولاً إلى المنطقة بين اللقمتين الأمامية في الجزء العلوي من الظنبوب. استخدم ضغطاً ثابتاً وقوياً مع حركة ثقب طفيفة لتوجيه الإبرة بعناية عبر صفيحة النمو. عند اختراق صفيحة نمو الظنبوب، ستواجه الإبرة مقاومة أقل بشكل ملحوظ.

استخدم حركة جانبية لطيفة للإبرة للتأكد من وجودها داخل عظم الظنبوب وعبر صفيحة النمو. ستكون الحركة محدودة إذا كانت الإبرة في الموضع الصحيح داخل عظم الظنبوب. اضغط المكبس ببطء لحقن 10 µL من محلول الخلايا.

يجب ألا تشعر بأي مقاومة أو مقاومة طفيفة في هذه المرحلة. بعد ذلك، اسحب الإبرة ببطء. أخرج الفأر من التخدير وأبقه على وسادة تدفئة حتى يفيق.

يتم مراقبة الفأر مرتين إلى ثلاث مرات أسبوعياً. وتُجرى مجموعة متنوعة من تقنيات التصوير مثل لوسيفيراز (luciferase)، والفلورة ببروتين GFP، والأشعة السينية (x-ray) على الفئران المخدرة. وتشير الفلورة إلى مناطق الورم.

يُستخدم مسح estron لتحديد موقع الآفات. وترتبط هذه الآفات بصور الفلورسنت. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول تقنيات التصوير في الجزء المكتوب من هذا البروتوكول.

بعد 21 إلى 35 يوماً من الحقن، يتم التضحية بالفئران باستخدام طريقة معتمدة من لجنة الرعاية والمؤسسية لاستخدام الحيوانات (iacuc)، وتُحفظ العظام في 4%Formalin. يُجرى تحليل ex vivo باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro CT) والتحليل النسيجي المورفولوجي (histo morpho) مع صبغ الهيماتين وDSN على العظام المعزولة. يمكن العثور على التفاصيل في البروتوكول المكتوب الذي يلي التلقيح داخل القلب أو داخل الظنبوب للخلايا الورمية.

يتم مراقبة الفئران أسبوعياً عن طريق التصوير الشعاعي والتفلور أو التألق الحيوي. وتظهر الآفات عادةً بالأشعة السينية بين الأسبوعين الثاني والثالث. وبينما قد تكون مرئية بالتفلور والتألق الحيوي في وقت مبكر من الأسبوع الثاني، اعتماداً على النموذج الموضح هنا، فإن الآفات تظهر كفجوات داكنة في العظام وقد تصبح أكثر وضوحاً مع مرور الوقت. تم قياس الآفات كمياً باستخدام تحليل metamorph للصور الشعاعية والصور التفلورية.

تم التحديد الكمي باستخدام برنامج Maestro لالتقاط الصور وتحليلها. وفي هذا الشكل، تم تحديد فقدان العظام كمياً عبر تحليل الـ micro CT. وقد عُرضت البيانات الهيكلية والمعدنية للعظام المستمدة من قياسات الـ micro CT كصور ثلاثية الأبعاد لعظم سليم وعظم مصاب بورم، حيث تظهر مناطق تآكل العظام كفراغات.

أُجري بعد ذلك تحليل القياسات المورفولوجية النسيجية (Histo morph geometry) على العينات لتحديد عبء الورم ونسبة حجم العظم إلى حجم النسيج. وأثناء محاولة تنفيذ هذه الإجراءات، من المهم التحلي بالصبر ووضع كل فأر بعناية، ومراقبة الفئران عن كثب؛ فإذا بدأت في النفوق، فمن المرجح أن يكون ذلك بسبب تكتل الخلايا، وفي هذه الحالة يجب تحضير خلايا جديدة على الفور.

إن أسوأ ما يمكنك فعله هو التسرع في الإجراءات أو الشعور بالإحباط. تذكر أنه مع المزيد من الممارسة والوقت، ستتحسن مهاراتك وتزداد سرعتك. لقد مهدت هذه التقنيات الطريق لباحثي السرطان لدراسة النقائل العظمية في الجسم الحي (in vivo) بعد تطويرها.