نماذج من الانبثاث العظام

الهدف العام من هذا الإجراء هو حقن الخلايا الورمية بطريقة تحفز نمو الخلايا الورمية في العظم وما يلي ذلك من تدمير للعظام. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إعادة تعليق الخلايا الورمية في محلول PBS بارد ووضعها على الثلج. بعد ذلك، يتم حقن عدد مناسب من الخلايا في البطين الأيسر للقلب أو في عظمة الظنبوب لفأر مخدّر.

بعد ذلك، يتم رصد نمو الورم العظمي ومعايير العظام بشكل طولي عبر تقنيات تصوير متعددة. وأخيراً، يتم إجراء التحديد الكمي النهائي لمعايير الورم والعظام. وفي نهاية المطاف، يتم استخدام مزيج من التصوير الفلوري أو التألقي في الجسم الحي وخارجه، والتصوير الشعاعي ثنائي الأبعاد، والتصوير ثلاثي الأبعاد.

يُستخدم التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (Micro CT) وعلم الأنسجة لإظهار نمو الورم والتغيرات في البيئة الدقيقة للعظام على المستويين الخلوي والهيكلي للنمو. ويمكن لهذه الطرق أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال نقائل السرطان، مثل العوامل الموجودة في العظام والتي تسمح بالاستعمار النقائلي لسرطان الثدي والبروستاتا. ستقوم أليسا ميركل، المساعدة البحثية في مختبري، بشرح تحضير الخلايا، مع الحفاظ على الخلايا لمدة تقل عن أسبوع واحد.

تُحضن مستنبتات خلايا M-D-A-M-B 2 3 1 الموسومة بـ GFP في وسط DMEM يحتوي على 10% FBS و 0.1 mg/mL من البنسلين والستربتومايسين عند درجة حرارة 37 °C وفي جو يحتوي على 5 إلى 8% CO₂. تُمرر الخلايا عندما تصل نسبة التلاقي إلى 80 إلى 90% وتُستبدل بتخفيف 1:10. ولتجهيز الخلايا للتلقيح، يتم تعريضها للتريبسين عند نسبة تلاقي 80 إلى 90% باستخدام 10 mL من 0.15% trypsin EDTA.

باستخدام وسط DMEM مبرد بالثلج مع 10% FBS، يتم نقل الخلايا فوراً إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر ثم يتم إجراء عملية الطرد المركزي لمدة خمس دقائق. يتم إعادة تعليق الراسب في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر في 25 ملليلتر من محلول PBS مبرد بالثلج وخالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم، ثم يتم عد الخلايا، وإعادة تعليقها في محلول PBS مبرد بالثلج بتركيز 10⁶ خلية لكل ملليلتر من أجل التلقيح داخل القلب، و250,000 خلية لكل ملليلتر من أجل الحقن داخل عظمة الظنبوب.

تُستخدم في هذه التجارب إناث الفئران التي تعاني من نقص المناعة وتتراوح أعمارها بين أربعة إلى ستة أسابيع، والتي تم تغذيتها بنظام غذائي Tela 29 20 x لمدة تتراوح من خمسة إلى 10 أيام قبل الحقن. بعد تخدير الفأر في غرفة تحتوي على 2.5% isof fluorine، يُنقل الفأر تحت غطاء تهوية إلى قناع أنفي ويُوضع الفأر على ظهره. يُستخدم محلول povidone iodine بتركيز 10% لغسل منطقة الصدر، يليه 70% Ethanol.

حدد منطقة الحقن في صدر الفأر في المنتصف بين الثلمة القصريّة وأعلى الناتئ الخنجري وإلى اليسار قليلاً من عظمة القص. بعد ذلك، وباستخدام حقنة أنسولين مقاس 28 gauge وسعة 300 µL وطول نصف بوصة، اسحب فقاعة صغيرة من الهواء لإيجاد مساحة بين المكبس والسطح المقعر للسائل، ثم اسحب 100 µL من الخلايا مع شد جلد الفأر بإحكام بيد واحدة.

أبقِ الإبرة في وضع عمودي، وعند إدخالها بنجاح في البطين الأيسر للقلب، يجب أن يظهر نبض واضح من الدم الأحمر الزاهي داخل المحقنة. عند هذا العمق، اضغط على مكبس المحقنة بعناية دون تحريك الإبرة بشكل ملحوظ لتجنب ثقب القلب أو تسرب الخلايا إلى التجويف الصدري. وللتقليل من تقطير الخلايا داخل التجويف الصدري، اسحب المكبس قليلاً للأعلى لخلق قدر بسيط من الضغط السلبي.

بعد ذلك، اسحب الإبرة مباشرة من الصدر مع الحرص على تجنب إمالتها أثناء الإزالة، لأن ذلك قد يؤدي إلى تمزق غشاء القلب والتسبب في نزيف. قم بتطبيق ضغط خفيف فوق موقع الحقن لتقليل النزيف لمدة دقيقة واحدة تقريبًا. وأثناء إزالة المخروط الأنفي، انقل الفأر إلى وسادة تدفئة حتى يستعيد وعيه بالكامل.

قبل البدء مباشرة في الإجراء داخل عظم الساق، احقن الفأر بـ bup printex. بعد تخدير الفأر ووضعه في القمع الأنفي، قم بتنظيف الساقين باستخدام بوفيدون يود بتركيز 10%، يليه الإيثانول باستخدام تقنية الأصابع الأربعة والإبهام.

أمسك بلطف بالكعب الوحشي والكعب الإنسي والنصف السفلي من عظمة القصبة. ثم اثنِ الساق بحيث تكون الركبة مرئية ويمكن الوصول إليها. باستخدام 70% ethanol، بلل الجلد لزيادة رؤية رباط الرضفة الكامن تحته، والذي يجب أن يظهر كخط أبيض سميك ومميز أثناء الإمساك بالكاحل بإحكام.

أدخل إبرة قياس 28 بطول نصف بوصة تحت الرضفة عبر منتصف الرباط الرضفي وصولاً إلى المنطقة بين اللقمية الأمامية في الجزء العلوي من الظنبوب. استخدم ضغطاً ثابتاً وقوياً مع حركة ثقب خفيفة لتوجيه الإبرة بعناية عبر صفيحة النمو. وعند اختراق صفيحة نمو الظنبوب، ستواجه الإبرة مقاومة أقل بشكل ملحوظ.

استخدم حركة جانبية لطيفة للإبرة للتأكد من وجودها داخل عظمة الظنبوب وعبر صفيحة النمو. ستكون الحركة محدودة إذا كانت الإبرة في الموضع الصحيح داخل عظمة الظنبوب. اضغط المكبس ببطء لحقن 10 µL من المحلول الخلوي.

لا ينبغي الشعور بمقاومة تذكر أو لا يشعر بأي مقاومة على الإطلاق في هذه المرحلة. ثم يتم سحب الإبرة ببطء. يتم إخراج الفأر من التخدير ووضعه على وسادة تدفئة حتى يستعيد وعيه.

راقب الفأر مرتين إلى ثلاث مرات أسبوعياً. يتم إجراء مجموعة متنوعة من تقنيات التصوير مثل لوسيفيراز (luciferase)، وفلورة GFP، والأشعة السينية (x-ray) على الفئران المخدرة. وتشير الفلورة إلى مناطق الورم.

يُستخدم مسح estron لتحديد مواقع الآفات. وتتوافق هذه الآفات مع صور الفلورية. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول تقنيات التصوير في الجزء المكتوب من هذا البروتوكول.

بعد مرور 21 إلى 35 يوماً من الحقن، يتم التضحية بالفئران باستخدام طريقة معتمدة من لجنة الرعاية والمؤسسية لاستخدام الحيوان (iacuc)، وتُحفظ العظام في 4%Formalin. أجرِ تحليلاً خارج الجسم (ex vivo) باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro CT) والتحليل النسيجي المورفولوجي (histo morpho) مع صبغ الهيماتين وDSN على العظام المعزولة. يمكن العثور على التفاصيل في البروتوكول المكتوب الذي يلي التلقيح داخل القلب أو داخل الظنبوب للخلايا الورمية.

يتم مراقبة الفئران أسبوعياً عن طريق التصوير الشعاعي والتفلور أو التلألؤ البيولوجي. تظهر الآفات عادةً عبر الأشعة السينية بين الأسبوع الثاني والثالث. وبينما قد تكون مرئية عن طريق التفلور والتلألؤ البيولوجي في وقت مبكر من الأسبوع الثاني، اعتماداً على النموذج كما هو موضح هنا، فإن الآفات تظهر كفجوات داكنة في العظام وقد تصبح أكثر وضوحاً مع مرور الوقت. تم قياس الآفات كمياً باستخدام تحليل metamorph للصور الشعاعية والصور التفلورية.

تم القياس الكمي باستخدام برنامج Maestro للحصول على الصور وتحليلها. في هذا الشكل، تم قياس فقدان العظام كمياً باستخدام تحليل micro CT. تم عرض بيانات بنية العظام والمعادن المستمدة من قياسات micro CT كصور ثلاثية الأبعاد لعظم سليم وعظم مصاب بورم، حيث تظهر مناطق تدمير العظام كمنطقة فارغة.

تم بعد ذلك إجراء قياسات الهندسة المورفولوجية النسيجية على العينات لتحديد عبء الورم ونسبة حجم العظم إلى حجم النسيج. وأثناء تنفيذ هذه الإجراءات، من المهم التحلي بالصبر وتوزيع كل فأر بعناية، مع مراقبة الفئران بدقة؛ فإذا بدأت في النفوق، فمن المرجح أن يكون ذلك بسبب تكتل الخلايا، وفي هذه الحالة يجب تحضير خلايا جديدة على الفور.

إن أسوأ ما يمكنك فعله هو التسرع في الإجراءات أو الشعور بالإحباط. تذكر أنه مع المزيد من الممارسة والوقت، ستصبح أكثر مهارة وسرعة. لقد مهدت هذه التقنيات، بعد تطويرها، الطريق لباحثي السرطان لدراسة النقائل العظمية في الجسم الحي (in vivo).