السلف المستمدة من نظام الثقافة دبقية قليلة التغصن من دماغ الجنين البشري

يوضح هذا الفيديو طريقة لتمايز الخلايا السلفية العصبية للجنين البشري الأولي إلى خلايا الدبقية قليلة التغصن. يتم استزراع الخلايا السلفية العصبية الأولى في وسط السلف إلى الطلاقة المشتركة C. ثم يتم استبدال وسط السلف بوسط الخلايا قليلة التغصن ، مع استكمالها بعوامل النمو التي تعزز عملية التمايز. ثم يتم زراعة الخلايا وتوسيعها لمدة ثلاثة أسابيع.

ثم يتم استبدال عامل النمو المكمل بوسط الخلايا قليلة التغصن بوسط الخلايا قليلة التغصن بدون عوامل نمو ، ويتم زراعة الخلايا لمدة ستة إلى 10 أيام إضافية حتى تظهر التغيرات المظهرية عن طريق الفحص المجهري. ثم يتم تأكيد التمايز عن طريق الفحص المجهري المناعي وقياس التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بسلالة قليلة التغصن. في النهاية ، يمكن استخدام الخلايا قليلة التغصن المتمايزة بنجاح في الدراسات المختبرية لبيولوجيا الخلايا قليلة التغصن والتفاعلات مع العوامل المعدية مثل فيروس الورم المتعدد البشري ، JCV.

واحدة من المزايا الحقيقية للتقنية التي أنشأناها في هذا المختبر مقارنة بما هو موجود بالفعل في الأدبيات المنشورة هي أنه في نظامنا ، يمكن زراعة الخلايا الدبقية قليلة التغصن وتمايزها دون الحاجة إلى خلايا داعمة مثل الخلايا النجمية والخلايا العصبية. نعتقد أن ميزة أخرى لبروتوكولنا هي أنه يجعل من الممكن زراعة عدد كبير من هذه الخلايا قليلة التغصن السليفة التي تعبر عن علامات مثل oh four التي يمكن زراعتها في ثقافة مسببات الأمراض لعدة أسابيع في أعداد كبيرة من مجموعات الخلايا مع الحفاظ على نمطها الظاهري. تعطينا النتيجة النهائية للتمايز مجموعة نقية تقريبا من الخلايا قليلة التغصن.

قلنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قرأنا الأدبيات الواسعة حول التمايز في المختبر للخلايا قليلة التغصن في الفئران وخلاياي. أيضا كان محقق مختلفة يزيل عاملات النمو من الثقافات ضيقة [إين وردر تو] أكملت التمايز من الخلايا. ستظهر هذا الإجراء مع بروتوكولنا أليكسا باندون ، طالبة جامعية في مختبرنا هنا في N-I-N-D-S.

استعدادا للتمايز ، قم بتنمية مجموعة متعددة الإمكانات من الخلايا السلفية العصبية على قوارير مطلية بالبولي ليسين في الوسط القاعدي العصبي ، مع استكمالها ب BFGF و EGF ، وتخلص من أي خلايا غير مستخدمة. بعد 11 ، عندما تكون الثقافة حوالي 70 إلى 80٪ ملتقية ، ابدأ التمايز. للقيام بذلك ، استنشق وسط السلف من القوارير.

اشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ثم أضف 12 مل من وسط oligo مع عوامل النمو. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد أسبوع واحد ، ستظهر الخلايا المتبقية مورفولوجيا ضيقة ثنائية القطب.

بمجرد أن تكون الخلايا المتمايزة متقاربة بنسبة 70٪ على الأقل ، قم بإزالة الوسط ونقله إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلترا. ضع الوسط المكيف المحفوظ جانبا لاستخدامه لاحقا. ثم أضف بسرعة أربعة ملليلتر من 0.05٪ تريبسين ، 0.1٪ EDTA إلى الخلايا ، واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

النقر برفق على القارورة عدة مرات للمساعدة في انفصال الخلية. بعد الحضانة ، قم بإخماد الرحلات عن طريق إضافة أربعة إلى خمسة ملليلتر من الوسط المكيف المحفوظ إلى القارورة. بعد ذلك ، انقل الوسط والخلايا مرة أخرى إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.

ثم قم بالطرد المركزي للوسط والخلايا عند 310 RCF لمدة سبع دقائق من درجة حرارة الغرفة. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، استنشق الأكل. أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق النقر برفق على الأنبوب ثم إضافة وسط أوليغو جديد مع عوامل النمو.

قم بتحريك الماصة والخلايا برفق لأعلى ولأسفل لعمل تعليق خلوي موحد. عد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي. ثم انقل 2.5 مليون خلية إلى قوارير T 75 مطلية ببولي دي ليسين ، ووضع المزرعة في الحاضنة بعد ثلاثة أسابيع عندما تكون الخلايا 80 إلى 85٪ متجانسة ، قم بشفط وسط oligo مع عوامل النمو من القارورة.

اشطفها مرة واحدة باستخدام PBS ثم أضف 12 مل من وسط oligo بدون عوامل نمو وأربعة ملليلتر من الوسط غير المشروط للخلايا العصبية المشتقة من السلف. حافظ على الخلايا في هذا الوسط لمدة ستة إلى 10 أيام في أيام متناوبة. افحص الخلايا عن طريق الفحص المجهري للتباين الطوري لتقييم التمايز والطلاقة المشتركة واستبدال ما لا يقل عن 50٪ من الوسط بعد الانسحاب من عوامل النمو ، ستقوم الخلايا تدريجيا بتطوير عمليات متعددة تشير إلى التمايز الناجح للخلايا إلى خلايا قليلة التغصن المشتقة من السلف.

في هذه المرحلة ، يمكن استخدام الخلايا قليلة التغصن المشتقة من السلف لقياس التدفق الخلوي أو تجارب التألق المناعي كما هو موضح في الأقسام القادمة من هذا الفيديو. يقارن مقايسة قياس التدفق الخلوي اكتساب علامات الخلايا قليلة التغصن أثناء عملية التمايز في العلاقة مع تلك الخاصة بالسكان الأبويين. تستخدم الخلايا السلفية العصبية البشرية كعناصر تحكم C 2.5 مليون خلية قليلة التغصن المشتقة من السلف في كل من قارورتين T 75 مطلية ببولي دي ليسين في وسط أوليغو مع عوامل النمو ، حاضنة 37 درجة مئوية بعد أسبوع ، استبدل الوسط في قارورة واحدة بوسط أوليغو طازج يحتوي على عوامل نمو كعنصر تحكم في بقاء الخلية.

استبدل الوسط الموجود في القارورة الثانية بوسط أوليغو طازج بدون عوامل نمو. زراعة هذه الخلايا لمدة تصل إلى 10 أيام ، بعد ثلاثة إلى تسعة أيام من إزالة عوامل النمو ، ستبدأ الخلايا في اكتساب المزيد من العمليات النموذجية للنمط الظاهري للخلايا قليلة التغصن. لفصل خلايا الخلايا قليلة التغصن المشتقة من السلف ، قم بشفط الوسط وأضف 5.25 مل من محلول محيط إلى كل قارورة.

يستخدم بيريان بدلا من التربسين لأنه له تأثير أكثر رقة على الخلايا أثناء التفكك. الحفاظ على مورفولوجيا الخلوية تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة. تحقق بشكل دوري من انفصال الخلايا باستخدام المجهر.

بمجرد فصل الخلايا ، أضف خمسة ملليلتر من العرض المتوسط أو بدون عوامل النمو لإيقاف التفاعل. بعد ذلك ، انقل محتويات كل قارورة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. استخدم Centrif الأنابيب عند 310 RCF لمدة سبع دقائق من درجة حرارة الغرفة بعد الطرد المركزي ، وشفط السوبينات وإعادة تعليق كريات الخلية في أربعة ملليلتر من الوسط الفسيولوجي الطبيعي ، مع استكمال ملليغرام واحد لكل مليلتر ، ألبومين مصل البقر أو NPM بالإضافة إلى BSA.

ثم عد الخلايا كما كان من قبل ، ثم لكل حالة تلطيخ مناعي ، Eloqua 1 مليون خلية في أنبوب بولي بروبيلين سعة خمسة ملليلتر. تأكد من تضمين جميع الضوابط المناسبة لتأكيد خصوصية كل كاشف منعي. بجانب إجراء التلوين المناعي ، يتم تحضين الخلايا أولا بأجسام مضادة ضد البروتينات السطحية ، A two B 5 و 0 4 و gal C ، ثم يتم غسل الخلايا لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة واحتضانها بالأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلوروكروم المناسب.

ثم يتم غسل الخلايا مرة أخرى لإزالة الأجسام المضادة الثانوية. يتم تثبيتها بنسبة 2٪ بارالديهايد وتتخللها البرد ، 70٪ من الإيثانول ثم لتلطيخ البروتينات داخل الخلايا ، يتم غسل الخلايا ، ثم تحضينها بأجسام مضادة ضد التعشيش ، والألياف الدبقية ، والبروتين الحمضي ، والفئة الثالثة بيتا توبولين وبروتين المايلين الأساسي. بعد عدم الربط ، يتم غسل الأجسام المضادة الأولية.

يتم تحضين الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية ذات الفلوروكروم المناسبة. أخيرا ، للتمييز بين الخلايا السليمة وتحت الخلوية الحطام أثناء تحليل قياس التدفق الخلوي ، استمرت الخلايا بأربعة ستة DIA medino. يقوم اثنان من الفينول ليند ثنائي هيدروكلوريد أو دابي بقياس التدفق الخلوي على أداة مجهزة بثلاثة ليزر ، والتي توفر أطوال موجية للإثارة مضبوطة على 4 88 نانومتر ، 6 47 نانومتر ، وإعداد UV.In واسع للفحص المجهري المناعي ، وإعداد ستة بولي دي ليسين مطلي.

ست ألواح بئر تحتوي على 250،000 خلية من الخلايا قليلة التغصن المشتقة من السلف لكل بئر. هناك حاجة إلى لوحين لكل نقطة زمنية. واحد مزروع بعوامل النمو والآخر بدون عندما تكون الخلايا 70 إلى 80٪ ملتقية.

استنشق الوسط بعوامل النمو من اللوحة. اشطفها مرة واحدة باستخدام PBS ثم أضف 12 مل من الوسط بدون عوامل نمو. قم بإجراء تلطيخ مناعي لمدة خمسة وتسعة أيام بعد سحب عوامل النمو على النحو التالي ، أولا ، قم بإصلاح الخلايا بنسبة 2٪ PFA لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، تخلص من PFA واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS خمس دقائق في كل مرة. ثم الخلايا التي تحتوي على 0.25٪ تريتون ثم لمنع خلايا كتلة الارتباط غير المحددة مع مصل الحصان 2٪ و 10٪ مصل الماعز. بعد الحظر ، احتضان الخلايا بالأجسام المضادة ضد بيتا ثلاثة توبولين ، و G-F-A-P-M-VP oh four ، و gal C. ثم اغسل الأجسام المضادة غير المرتبطة من الخلايا واحتضان الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية المسماة بالفلوروكروم المناسب.

اغسل الأجسام المضادة الثانوية غير المرتبطة من الخلايا ثم تجنب التبييض الضوئي واحتجازه. جبل النواة. ينزلق الغطاء باستخدام 10 ميكرولتر من الذهب المطول مع نقطة في البوصة.

تصور الخلايا المصنفة باستخدام مجهر مضان مع مجموعة المرشح المناسبة لتحديد ما إذا كانت الخلايا السلفية العصبية البشرية الأولية يمكن أن تتمايز إلى خلايا الدبقية قليلة التغصن. تمت زراعة الخلايا السلفية العصبية متعددة القوة كما هو موضح في هذا الفيديو. ثم تمت مراقبة التغيرات المظهرية عن طريق قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري المناعي.

كما يتضح هنا. تعبر غالبية الأسلاف العصبية عن تعشيش علامة الخلايا الجذعية الظهارية العصبية ، في حين أن مجموعات سكانية فرعية صغيرة فقط تعبر عن علامات مقيدة للنسب مثل علامة الخلايا النجمية ، و GFAP ، أو العلامة العصبية ، أو توبولين بيتا من الفئة الثالثة ، أو علامة الخلايا الدبقية قليلة التغصن أوه أربعة. عندما تم استبدال وسط الاستزراع بوسط أوليغو بالإضافة إلى عوامل النمو وتم استزراع الخلايا لمدة أسبوع واحد ، لوحظ انخفاض تعبير التعشيش وزيادة تعبير A two B five بعد أسبوعين.

انخفض تعبير التعشيش بشكل أكبر وزاد التعبير عن علامة السلائف الدبقية العصبية ، A two B five زاد من التعبير عن علامة أخرى للخلايا قليلة التغصن oh أربعة أيضا زيادة بعد يومين من انسحاب عامل النمو. أوه ، زادت أربعة تعبيرات وتعبير عن GAL C.A زادت علامة الخلايا قليلة التغصن المتأخرة بعد ستة أيام من انسحاب عامل النمو. زاد التعبير المشترك ل oh four و gal C وكان مشابها للتعبير المشترك ل gal C و MBP.

يكشف التلوين المناعي متعدد الحلقات أن 72٪ من الخلايا في المزرعة عبرت عن MBP. تم تمييز دليل إضافي على تمايز الخلايا قليلة التغصن المشتقة من السلف باستخدام مقايسة التألق المناعي. بعد يومين من سحب عوامل النمو ، تم الكشف عن تعبير MVP الموضح باللون الأخضر.

تم زيادة هذا في اليوم الخامس وزاد في اليوم التاسع. يتضح توطين MVP في الخلايا قليلة التغصن المتمايزة. مجتمعة ، تشير هذه البيانات إلى أن ثقافات الخلايا السلفية العصبية للجنين البشري باستخدام الطريقة الموصوفة قادرة على التكاثر في المختبر مع الحفاظ على القدرة على التمايز من خلال مراحل سلالات الخلايا قليلة التغصن.

بعد تطوير هذا البروتوكول ، تسمح هذه التقنية للباحثين في مجالات علم الأحياء التنموي وعلم فيروسات علم الأعصاب بالتحقيق في بيولوجيا الدماغ البشري والأمراض التي تصيب الدماغ البشري ، وخاصة تلك التي تؤدي إلى أمراض المادة البيضاء.