كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية
أبريل 23, 2013
نحن تصف طريقة الكهروكيميائية فحص جهاز استشعار للكشف عن بكتيريا السريع وتحديد الهوية. الفحص ينطوي على مجموعة أجهزة الاستشعار functionalized مع الحمض النووي قليل النوكليوتيد تحقيقات لالتقاط الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) تسلسل أنواع محددة. تهجين شطيرة من الريباسي الهدف مع التحقيق القبض على والفجل البيروكسيداز المرتبطة الحمض النووي للكشف عن قليل النوكليوتيد التحقيق تنتج تيارا تجاه المؤثرات الخارجية قابلة للقياس.
الهدف العام من التجربة التالية هو اكتشاف البكتيريا وتحديدها باستخدام أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إطلاق الحمض النووي الريبي الريبوسومي أولا من البكتيريا للسماح بالتهجين باستخدام مسبار الكاشف المفلور كخطوة ثانية ، تتم إضافة الحمض النووي الريبي الريبوزومي المرتبط بمسبار الكاشف إلى القطب الكهربائي العامل ، مما يسمح بالتهجين مع مسبار الالتقاط على سطح المستشعر. بعد ذلك ، يسمح لمترافق بيروكسيداز الفجل الحصان المضاد للفلورسين بالارتباط بمسبار الكاشف المفلور.
أخيرا ، في التيار التداخل ، الذي ترتبط شدته بعدد مسبار الالتقاط الريبوسومي ، يمكن الحصول على مجمعات مسبار كاشف الحمض النووي الريبي على سطح المستشعر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق القائمة على الثقافة هي أنه يمكن اكتشاف البكتيريا والتعرف عليها في حوالي 45 دقيقة ، وتجنب الوزن بين عشية وضحاها. لكي تشكل البكتيريا مستعمرة مرئية على لوحة EDGAR ، فإن تطبيق هذه التقنية من شأنه أن يحسن إدارة الأمراض المعدية.
حيث أن الكشف المبكر عن مسببات الأمراض البكتيرية ضروري للعلاج بالمضادات الحيوية المستهدفة وتحسين النتائج السريرية. على الرغم من أن هذه الطريقة مفيدة لتشخيص الأمراض المعدية التي يمكن تطبيقها أيضا على مشاكل تشخيصية أخرى مثل التشخيص المناعي. ابدأ باحتضان مسبار الالتقاط الموسع باستخدام الهكسان دي ثيول لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لضمان تقليل مجموعة الثيول على مسبار الالتقاط ، مما يؤدي إلى نتائج أكثر اتساقا.
بعد الحضانة ، ضع تيارا من النيتروجين لتحمل الذهب. 16 شريحة مصفوفة مستشعر لمدة خمس ثوان لإزالة أي رطوبة أو جسيمات ، يجب تطبيق كميات صغيرة من السائل بعناية على القطب الكهربائي العامل في مجموعة المستشعر. العرض المرئي لهذه التقنية أمر بالغ الأهمية.
نظرا لأن أداء تقنيات سحب العينات والغسيل والتجفيف بشكل صحيح يقلل بشكل كبير من تباين الرقاقة إلى الرقاقة. بعد ذلك ، قم بتطبيق ستة ميكرولترات من مزيج مسبار الالتقاط الموسع HDT على القطب الكهربائي العامل لجميع أجهزة الاستشعار ال 16 من مجموعة المستشعرات وقم بتخزين رقائق المستشعر في طبق بتري مغطى عند أربع درجات مئوية طوال الليل في اليوم التالي ، واغسل رقائق المستشعر بالماء منزوع الأيونات لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان ، ثم جفف الرقائق تحت تيار من النيتروجين لمدة خمس ثوان. الآن قم بتطبيق ستة ميكرولترات من كلوريد الصوديوم ATTRI هيدروكلوريد ، محلول EDTA MERCAPTOETHANOL على القطب الكهربائي العامل لجميع أجهزة الاستشعار ال 16 ، واحتضان المستشعرات لمدة 50 دقيقة في طبق بتري في درجة حرارة الغرفة.
لتحضير العينات لمقايسة المستشعر الكهروكيميائي. انقل ملليلترا واحدا من الثقافة البكتيرية في مرحلة النمو اللوغاريتمية إلى أنبوب طرد مركزي صغير ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق عند 16 ، 000 جرام. يرجى ملاحظة أنه يجب التعامل مع البكتيريا المسببة للأمراض في غطاء السلامة الحيوية.
بعد إزالة الضربة ، ضع طرف ماصة يحتوي على 10 ميكرولترات من هيدروكسيد الصوديوم المولي على قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لإعادة تعليق الحبيبات تماما. بعد احتضان المعلق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، أضف 50 ميكرولترا من PBS الذي يحتوي على ألبومين مصل البقر أو BSA ومسبار كاشف معدل بالفلورسين لتحييد المحلل البكتيري. ثم احتضان المحللة المعادلة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ابدأ هذه الخطوة بغسل محلول المركابتو الإيثانول من إحدى رقائق المستشعر المعدة بالماء منزوع الأيونات لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان. بعد تجفيف الرقاقة كما هو موضح للتو ، ضع أربعة ميكرولترات من تحلل البكتيريا المعادلة على الأقطاب الكهربائية العاملة. 14 من أجهزة الاستشعار.
ثم قم بتطبيق أربعة ميكرولترات من قليل النوكليوتيد الجسر في PBS بالإضافة إلى مسبار الكاشف المعدل للفلورسين PBS بالإضافة إلى BSA على مستشعري التحكم الإيجابي. ثم بعد احتضان مستشعرات المحللة والتحكم الإيجابي لمدة 15 دقيقة ، اغسل ثم جفف شريحة المستشعر بالكامل كما كان من قبل. الآن ضع أربعة ميكرولترات من بيروكسيداز الفجل الحصان المضاد للفلوريسين أو HRP في PBS المحتوي على الكازين على الأقطاب الكهربائية العاملة لجميع أجهزة الاستشعار ال 16.
بعد حضانة لمدة 15 دقيقة ، اغسل وجفف شريحة المستشعر. بعد ذلك ، قم بتطبيق ملصق بئر فيلم على سطح شريحة المستشعر وقم بتحميل الشريحة في ماصة تثبيت رقاقة المستشعر 50 ميكرولترا من ركيزة TMB على جميع المستشعرات ال 16 وأغلق حامل شريحة المستشعر. أخيرا ، استخدم قارئ رقاقة Helios للحصول على قياسات قياس الحرارة والقياس عن بعد الدوري لجميع أجهزة الاستشعار ال 16.
تم تصميم الفحص الكهروكيميائي الموصوف للتو بشكل مشابه لشطيرة ، إليزا ، كما هو موضح في هذا الشكل ، يتم تطوير تهجين الحمض النووي الريبي مع مجسات الالتقاط والكشف عن طريق تفاعل الأكسدة والاختزال المحفز بواسطة HRP المقترن بشظايا الأجسام المضادة للفلورسين التي تربط ارتباط فلوريسين الصنوبر الثلاثة على مسبار الكاشف. أحد المكونات المهمة لحساسية الفحص هو كيمياء سطح القطب الذهبي. القطب الذهبي مغطى بالمركابتو الإيثانول وهاين أول ويتم تشغيله عن طريق إضافة مجسات التقاط متوسعة.
ينتج عن تهجين الساندويتش للحمض النووي الريبي الريبوزومي المستهدف مع مسبار الالتقاط ومسبار الكاشف المسمى بالفلورسين مركب يتم اكتشافه عن طريق إضافة الفجل الحصان المضاد للفلورسين ، وبيروكسيداز البيروكسيداز المترافق ، والركيزة TMB. يتم إنشاء التيار البارامتري M بواسطة دورة الأكسدة والاختزال الناتجة عن أكسدة TMB بواسطة بيروكسيداز الفجل وتقليل TMB بواسطة الإلكترونات من القطب. تستخدم المقايسات الموضحة هنا شريحة مصفوفة مستشعر سائلة جينية 16.
يحتويكل جهاز استشعار في المصفوفة على ثلاثة أقطاب كهربائية ، مرجع عمل ومساعد ، والتي لها نقاط اتصال على حافة الشريحة. يحتوي قارئ الرقائق على دبابيس بوجو تتصل بكل نقطة من نقاط الاتصال. يعمل قارئ الرقائق كواجهة لمجموعة المستشعرات باستخدام مقياس جهد يتم التحكم فيه بواسطة خوارزمية كمبيوتر.
هنا ، يتم عرض أمثلة على تدفق تيار المستشعر الكهروكيميائي. يكون التدفق الحالي في المستشعرات مرتفعا بشكل مصطنع في المستشعرات خلال الثواني القليلة الأولى بعد بدء القياسات البارامترية. نظرا لتراكم الركيزة المؤكسدة خلال الوقت من تطبيق TMB على سطح المستشعر ، إلى بدء خوارزمية القارئ ، يصل التدفق الحالي بسرعة إلى حالة مستقرة ويمكن الحصول على قراءات دقيقة للمستشعر بشكل موثوق في غضون 60 ثانية.
التباين بين المستشعر والمستشعر ثابت نسبيا ، لذلك من الممكن إجراء 16 فحصا مختلفا للمستشعر بالتوازي على رقاقة مصفوفة المستشعر السائلة 16 الجينات ضرورية كعنصر تحكم إيجابي. يتم استخدام قليل النوكليوتيد للحمض النووي الجسر الاصطناعي الذي يهجن مع كل من مجسات الالتقاط والكشف ويعمل كهدف اصطناعي للتركيز المعروف. تم الحصول على النتائج باستخدام وظيفة قليل النوكليوتيدات التجسيرية كعنصر تحكم في المعايرة الداخلية لتقليل تباين الرقاقة إلى الرقاقة.
كلما زاد التيار السالب للقطب ، زادت الإشارة. عند اختبار مجسات الالتقاط والكاشف. يجب تحديد حد الكشف عن طريق التخفيف التسلسلي لعينة ذات تركيز معروف كما هو موضح في هذا الشكل ، وهناك ارتباط سجل خطي بين تركيز العينة وخرج الإشارة عبر النطاق الديناميكي للمقايسة.
في هذه الرسوم البيانية الشريطية ، تظهر النتائج التمثيلية للعينات التي تحتوي على إيسيا القولونية وختم كليب والأمونيا ، والتي توجد بشكل متكرر في بول المرضى الذين يعانون من عدوى المسالك البولية ، إشارات لمعظم المستشعرات ستكون منخفضة ومتشابهة ، ويمكن تجميع هذه النتائج السلبية حيث يميز تفاعل إشارة الخلفية مع زوج مسبار KE الشريعة عن الإشريكية القولونية. يعمل قليل النوكليوتيد الجسر كمعيار للتحكم الإيجابي والمعايرة الداخلية. يمكن تطبيق هذه التقنية للكشف عن البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية في العينات السريرية عن طريق قياس استجابة النمط الظاهري للبكتيريا للمضادات الحيوية.
يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد العلاج الأمثل للمريض الفردي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف البكتيريا والتعرف عليها من خلال مقارنة التيارات المتاتريكية في أجهزة الاستشعار الخاصة بالأنواع المختلفة في الشريحة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة فحص مستشعر كهروكيميائي للكشف السريع عن البكتيريا وتحديدها. تستخدم الطريقة مجموعة مستشعرات وظيفية معدلة بمجسات التقاط أوليجو نيوكليوتيدات الحمض النووي التي تستهدف تسلسلات معينة من الحمض النووي الريبي الريبوسيمي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكيمياء الكهربائية
- علم الأحياء الدقيقة
- تكنولوجيا المستشعرات
الخلفية
- يمكن أن تستغرق الطرق التقليدية المستندة إلى الثقافة للكشف عن البكتيريا أكثر من 24 ساعة.
- تقنيات الكشف السريع ضرورية لإدارة الأمراض المعدية بشكل فعال.
- توفر المستشعرات الكهروكيميائية بديلاً واعدًا لتحديد سريع.
- الحمض النووي الريبي الريبوسيمي هو هدف رئيسي للكشف النوعي عن الأنواع.
غرض الدراسة
- تطوير فحص سريع للكشف عن البكتيريا باستخدام المستشعرات الكهروكيميائية.
- تحسين سرعة تحديد البكتيريا مقارنة بالطرق التقليدية.
- استخدام الحمض النووي الريبي الريبوسيمي كهدف للكشف النوعي.
الطرق المستخدمة
- إطلاق الحمض النووي الريبي الريبوسيمي من البكتيريا من أجل التهجين.
- استخدام مسبار كاشف مفلورا لربط الحمض النووي الريبي الريبوسيمي.
- تهجين الحمض النووي الريبي المرتبط بمكبرات الصوت مع مجسات التقاط على سطح المستشعر.
- قياس التيار الأمبيروميتري لت量 الكشف.
النتائج الرئيسية
- يسمح الفحص بالكشف عن البكتيريا وتحديدها في حوالي 45 دقيقة.
- يرتبط كثافة التيار الأمبيروميتري بكمية الحمض النووي الريبي المستهدف المأخوذة.
- تقوم هذه الطريقة بتقليل الوقت المطلوب لتحديد البكتيريا بشكل كبير.
- تشمل التطبيقات المحتملة تحسين إدارة الأمراض المعدية.
الاستنتاجات
- يعد فحص المستشعر الكهروكيميائي طريقة سريعة وفعالة للكشف عن البكتيريا.
- يمكن لهذه التقنية تعزيز التشخيصات السريرية وإدارة الأمراض المعدية.
- قد توسع الدراسات المستقبلية نطاق أنواع البكتيريا التي يمكن اكتشافها.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Rapid bacterial detection and identification within 45 minutes addresses a critical bottleneck in infectious disease management, enabling timely therapeutic decisions. This electrochemical sensor approach supports target validation by providing species-specific ribosomal RNA detection with quantitative amperometric readouts. The method enhances predictive confidence in early discovery by reducing reliance on slow culture-based assays and improving assay reproducibility across a 16-sensor array.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through specific ribosomal RNA hybridization and pathway clarification.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing functional target validation via sandwich hybridization of capture and detector probes.
- Scientific Value: Increases predictive confidence for portfolio triage by delivering quantitative current measurements correlated with target RNA concentration.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through consistent sensor surface functionalization with dilated capture probes.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via internal calibration using bridging oligonucleotide controls to minimize chip-to-chip variability.
- Scientific Value: Highlights screening readiness and platform reuse through parallel processing of 16 sensors on a gene fluidic array for reliable compound or sample evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through detection of urinary tract pathogens like E. coli and Klebsiella, aligning with translational biomarker applications.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling rapid phenotypic response measurement to antibiotics for optimum therapy determination.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking by linking electrochemical readouts to bacterial identification, supporting risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
Positions the method within early discovery to lead identification, supporting hypothesis testing and biological de-risking through specific rRNA detection.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification via species-specific ribosomal RNA hybridization.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility through quantitative amperometric current measurements and internal calibration controls.
- Analytics: Highlights measurements and statistical outputs that enable comparison of conditions across sensor arrays, including signal intensity correlation with target concentration.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through phenotypic response measurement to antibiotics for therapy optimization.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability via the 16-sensor array chip format, enabling parallel assays and cross-platform standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity in bacterial detection.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through sensor array design and calibration controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via rapid identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on 45-minute detection timelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrochemistry, molecular biology, and sensor surface chemistry for probe functionalization and assay execution.
- Needs instrumentation including potentiostat, sensor array chip reader, and fluidic handling systems for precise reagent delivery.
- Demands cross-team standardization in probe design, immobilization protocols, and data interpretation across microbiology and assay development groups.
- Involves adaptation considerations for different bacterial targets through redesign of capture and detector probe sequences based on rRNA variability.
- Includes practical limitations such as the need for bacterial lysis and RNA release steps, which may require biosafety containment for pathogenic samples.
