تصنيع واستخدام الخنزير ظهر أقطاب لMultibarrel في الجسم الحي التلاعب الدوائية من الردود العصبية

تهدف هذه الإجراءات إلى التطبيق الإيوني الموجه للعوامل الدوائية على الدوائر الدقيقة في الدماغ مع تسجيل النشاط العصبي في الوقت ذاته. أولاً، يتم سحب قطب زجاجي أحادي السطوانة لتسجيل خلية واحدة وثني طرفه. كما يتم سحب قطب زجاجي متعدد السطوانات وكسر طرفه للوصول إلى القطر المطلوب.

باشر في تجميع القطبين الكهربائيين. وفي النهاية، يُستخدم القطب الناتج للتسجيلات خارج الخلوية في الجسم الحي، حيث يمكن تطبيق العوامل الدوائية عند الطلب بالتناضح للتلاعب بالدوائر العصبية الدقيقة. مرحباً، أنا الدكتور Achim Klu، وسيوضح لكم مختبرنا اليوم كيفية إنتاج أقطاب متعددة الفوهات بنظام piggyback.

يمكن استخدام هذه الأقطاب الكهربائية لإدخال منشطات ومثبطات عصبية عبر ناقلات أيونية إلى البيئة الدقيقة للعصبون، وبالتالي التحكم في الدوائر العصبية للعصبون في الجسم الحي. مرحباً، أنا د. An Zillow، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبر د. Ah him Crow، وسأقوم باستعراض الإجراء اليوم. بالنسبة للقطب الكهربائي أحادي الفتحة، استخدم أنبوباً شعرياً زجاجياً أحادي الفتحة مع فتيلة، واسحب الطرف حتى يصل قطره إلى حوالي 1 إلى 2 µm وطول الساق من 10 إلى 12 mm.

تحقق من مقاومة القطب المسحوب بشكل متقطع عن طريق ملئه بـ sodium chloride بتركيز three molar واختباره باستخدام مقياس O قياسي في 0.9%saline. وبمجرد ملء القطب بمحلول ملحي، يجف المحلول بسرعة، مما يجعل القطب غير صالح للاستخدام؛ لذا، قم بإجراء هذا الاختبار فقط عند الضرورة.

قم بسحب بعض الأقطاب الكهربائية التي لن تُستخدم في إنتاج الأقطاب المتراكبة (piggyback). ولإنشاء قطب كهربائي متعدد الفوهات بالكامل، اسحب الزجاج حتى تصل رأس الماصة إلى قطر إجمالي يبلغ حوالي 10 micrometers أو أقل. ويُعد القطب الكهربائي ذو الرأس المسحوب بشكل صحيح أمراً بالغ الأهمية لضمان النجاح.

بالإضافة إلى كون الطرف طويلًا ونحيفًا، يجب أن يظل متماسكًا وقابلًا للكسر بسهولة للوصول إلى قطر الطرف المطلوب. سيتم كسر الطرف للوصول إلى القطر الصحيح في الخطوة التالية. لذا، فإن الحجم الدقيق للطرف أقل أهمية أثناء عملية التجميع من الشكل العام لطرف القطب، والذي يجب أن يكون طويلًا ونحيفًا نسبيًا.

الآن، أمسك القطب أحادي الفوهة بزاوية 45 درجة تقريبًا، مع توجيه الطرف للأسفل، وحركه عبر اللهب بسرعة نسبية. احرص على أن يقوم اللهب بصهر الزجاج في منطقة الانتقال على بعد 10 مليمترات تقريبًا من طرف القطب لثنيه بزاوية 20 درجة تقريبًا. ضع القطب متعدد الفوهات في سرير من صلصال النمذجة على شريحة زجاجية، ثم أدخله في منصات المجهر.

حامل الشريحة باستخدام أجهزة تحريك المحورين XY لمنصة المجهر، حرك طرف القطب الكهربائي برفق مقابل قطعة البلكسي جلاس. لاحظ كسر الطرف من خلال عدسات المجهر العينية. يظهر هنا إعداد تجميع القطب الكهربائي.

يتم تثبيت القطب متعدد الفوهات على شريحة زجاجية فوق طاولة المجهر. بينما يتم تثبيت القطب أحادي الفوهة بواسطة جهاز تحكم يدوي متعدد المحاور يسمح للمستخدم بخفض الماصة أحادية الفوهة فوق الماصة متعددة الفوهات بدقة عالية. قم بخفض القطب أحادي الفوهة مباشرة في التجويف الموجود في القطب متعدد الفوهات، والذي يتشكل من ترتيب الفوهات الخمس، بحيث يبرز طرفه عن طرف القطب متعدد الفوهات بمقدار يتراوح من 5 إلى 10 micrometers تقريبًا.

قم بلصق عمودي القطبين الكهربائيين معاً باستخدام السيانوأكريليت. ابدأ من الموضع الأكثر بعداً عن الأطراف، وحرك عود أسنان عليه قطرة من الغراء ببطء على طول عمودي القطبين باتجاه أطرافهما. إن وضع الغراء بالقرب من أطراف الأقطاب الكهربائية سيؤدي إلى انسدادها، مما يجعل القطب غير فعال جزئياً على الأقل.

املأ كمية صغيرة من الإسمنت السني. واتركه ليجف لمدة 15 دقيقة تقريباً. بعد ذلك، قم بإزالة القطب الكهربائي الملحق (piggyback electrode) المكتمل بعناية.

أولاً من حامل الميكرو-مانيبوليتور (micro manipulator)، ثم افصلها عن الشريحة الزجاجية. وقبيل استخدام القطب الكهربائي مباشرةً، استعد لملء كل أسطوانة بالعقار الخاص بها من الخلف. املأ الأسطوانات الأربع الخارجية في تكوين الأسطوانات الخمس بأربعة عقاقير مختارة، والأسطوانة المركزية بمحلول كلوريد الصوديوم بتركيز 3 M كأطوانة موازنة.

بعد ذلك، املأ قطب التسجيل أحادي البرميل بمحلول كلوريد الصوديوم بتركيز 3 molar. الآن، قم بتشغيل وحدات مضخة الرحلان الأيوني واختبر جميع البراميل. ستساعد وظيفة اختبار القطب في كل وحدة مضخة على تحديد ما إذا كان برميل القطب صالحاً للاستخدام في تسجيلات الدماغ العميقة.

يتكون القطب الكهربائي المكون من خمس أسطوانات عند تجميعه مع قطب تسجيل أحادي الأسطوانة من ساق طويلة يبلغ طولها حوالي سبعة مليمترات. تُستخدم عادةً العديد من المحفزات والمثبطات التشابكية مع عملية الرحلان الأيوني لمنع تثبيط الجلايسين باستخدام عقاقير مثل مضادات مستقبلات الجلايسين. وعادة ما يؤدي استخدام Trick nine hydrochloride إلى زيادة معدل إطلاق النبضات في العصبونات.

تقيس هذه البيانات العينة دالة معدل تفريغ الخلايا العصبية السمعية مقابل الشدة، وتظهر الاستجابات لمحفزات صوتية جيبية ذات شدة متزايدة يتم تقديمها إلى أذني الحيوان. أدت الأصوات الأعلى إلى معدلات نشاط كهربائي (spike rates) أعلى قبل تطبيق النين الصارم. وتظهر دالة شدة معدل الخلايا العصبية معدلات نشاط كهربائي منخفضة.

يؤدي تطبيق تيار أيوني أولي بقيمة 15 nano amps إلى تحفيز زيادة طفيفة في تيار الطرد. وتعمل تيارات الطرد الأعلى تدريجياً على غلق المزيد من مستقبلات glycine في العصبون، مما يؤدي إلى ارتفاع تدريجي في معدلات إطلاق الإشارات. وعند تيار بقيمة 45 nano amps، يبدو أن جميع مستقبلات glycine في ذلك العصبون قد تم غلقها بواسطة strict nine hydrochloride.

لم تؤدِ أي زيادة إضافية في تيار القذف وإطلاق المزيد من المادة إلى حدوث تغيير إضافي. أما بالنسبة لدالة مستوى معدل تفريغ العصبونات بعد إنهاء عملية الرحلان الأيوني، فيحدث تعافٍ كامل للاستجابات العصبية وعودتها إلى المستوى المرجعي بعد حوالي 25 دقيقة. وتعتمد عملية التعافي هذه على نوع وكمية الدواء المقذوف.

من المهم تذكر أن العقار سيتسرب إلى المنطقة المحيطة بموقع التسجيل وقد يغلق أيضاً المستقبلات في العصبونات المجاورة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دمج قطب تسجيل مع قطب عقاقير متعدد الفوهات للحصول على تسجيلات عميقة للدماغ ذات ضوضاء منخفضة، جنباً إلى جنب مع التحكم الزمني في إيصال ما يصل إلى أربعة عوامل فارماكولوجية.